전기영동 ELECTROPHORESIS 생물환경학과 김 정 호

전기영동 (Electrophoresis)  전기영동 (Electrophoresis)  전하를 띤 고분자 물질을 전기장을 띤 매질 ( 젤 ) 에서 이동 ∙ 분리 물질의 분리, 순도 ∙ 특성 분석 물질의 이동 방향과 속도는 charge, size, shape 에 따라 다름  전하를 띤 고분자 물질 : 전류의 방향에 따라 일정한 방향으로 이동 DNA, RNA, nucleotide Protein, peptide, amino acid Charged sugar, …

Gel electrophoresis  Matrix : pore size  Agarose : nucleic acids (500 bp ~ 30 kb) Polyacrylamide : proteins, nucleotides (1 ~ 300 bp) Starch  Tube (Cylindrical) Slab : Horizonal, Vertical  Power supply  전기영동에 사용되는 전류는 직류  교류 (A.C.) ⇨ 직류 (D.C)  Buffer

핵산의 전기영동  Nucleotide/Polynucleotide  Sugar (ribose/deoxyribose) + Base + Phosphate (PO 4 -3 ) 1 Phosphate/ 1 nucleotide : negative charge (poly)nucleotide 는 전기장에서 (+) 양극을 향해 이동

핵산의 전기영동  이동 속도 size : bp shape : supercoiled ccc, open circular, linear charge matrix : pore size (gel density) buffer : ionic strength current (voltage) ethidium bromide (EtBr)

Agarose Gel Electrophoresis

 Preparation of Gel (Gel casting)  Agarose 의 농도 (%, w/v) 에 따라 분리 가능한 DNA 의 크기 0.3% : 5 ~ 60 kb 0.6% : 1 ~ 20 kb 0.9% : 0.5 ~ 7 kb 1.2% : 0.4 ~ 6 kb 1.5% : 0.2 ~ 3 kb 2.0% : 0.1 ~ 2 kb  Polyacryamide gel 1 ~ 300 bp sequencing gel, small RNA (microRNA)  Buffer TBE (Tris-Borate-EDTA) : 5X stock solution TAE (Tris-Acetate-EDTA) : 50X stock solution

 Sample loading  Sample loading buffer (Loading dye) : 6X Buffer Dense, viscous substance: Glycerol, Sucrose, Ficoll ®, … Tracking dye : Xylene cyanol : sky blue, 4 kb DNA Bromophenol blue : purple, 300 bp dsDNA SDS  DNA size marker : DNA Ladder

 Separation of DNA fragments (Running)  Running buffer  Power supply +/- voltage/current control

 Visualization (Staining & Photographing)  Ethidium bromide (EtBr) intercalating agent pink fluorescence under UV (eye protection required) mutagenic, carcinogenic

separation-of-dna-fragments

다면전기영동 (PFGE)  다면전기영동 (PFGE, Pulsed-field gel electrophoresis)  For large DNA (40 kb ~ 5 Mb) YAC(Yeast Artificial Chromosome) BAC (Bacterial Artificial Chromosome)  전기장이 서로 다른 두 방향 사이로 0.1 초부터 1,000 초의 시간 간격 (pulse time) 으로 주기적으로 바뀜

 PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis)  FIGE (Field inversion gel electrophoresis)  TAFE (Traverse alternating-field electrophoresis)  RGE (Rotating gel electrophoresis)  CHEF (Contour-clamped homogeneous electric field)