충북대학교 식품공학과 조윤원, 이은숙 Preparation, characterization and in vitro release of chitosan nanoparticles loaded with gentamicin and salicylic acid

Contents 1. Introduction 2. Materials and methods 2.1. Materials 2.2. Preparation of compound CS nanoparticles 2.3. Characterization of GM/SA compound CS nanoparticles 2.4. Determination of drugs loading capacity of nanoparticles 2.5. In vitro release studies 3. Results and discussion 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles 3.3. In vitro release studies of GM/SA-loading CS nanoparticles 4. Conclusion

Introduction Gentamicin(GM) Aminoglycoside 계 항생제 Micromonospora purprea 및 Micromo echinospora 가 생산하는 아 미노 배당체계의 항생물질 겐타마이신 C1, C2, C1a 의 혼합물 특히 Gram(-) 균에 효과적 Side effects- 청각상실 (ototoxicity), 신장손상 (nephrotoxicity) 예방법 - glutathione, salicylic acid, aspirin 이 free radical 을 소거하여 GM 의 ototoxity 를 예방

Introduction GM 과 SA 의 Separating injection 의 단점 GM 1/1day, SA 2/1day => 환자들이 불편 Free radical 이 발생하면 높은 activity 로 인해 주변 macromolecule 와 반응 GM 의 Free radical 의 ototoxicity 를 효과적으로 억제하기 위해서는 scavenger 는 Free radical 이 생성되자마자 반응할 수 있어야 함. 따라서 Separating injectiond 은 체내에서 GM 과 SA 의 미미한 조절 을 야기하고 결과적으로 SA 의 길항작용을 줄여줌.

Introduction Nanoencapsulation 의 이점 특정 사이트에 작용하는 것과 약리성분 방출의 조절과 같은 적절 한 delivery system 은 약의 생체이용률을 개선하고 부작용을 최소 화 할 수 있음. NPs 는 약효의 상실로부터 약물을 보호하고 캡슐화되거나 흡수된 약물의 방출을 제어함. 의약품의 nanoencapsulation 은 선택된 조직에서의 흡수의 강화와 세포내 침투, 이용률, 유지시간을 개선하여 약물사용의 비용과 독 성의 위험을 줄 일수 있음.

Introduction Chitosan CS, PGLA, PLA 는 NPs 의 합성에 이용됨. CS 는 자연발생적이고 다량으로 이용할 수 있는 polysaccharide 로 chitin 의 N-deacetylation product 임. CS 의 상대분자량은 수천수백에서 수백만임. CS 와 유도체 - 제약과 의약에 널리 사용 좋은 생물학적 특성 (biocompatibility, biodegradability, antibacterial activity) 빠른 치유 (fungistatic, anticancerogen, anticholesteremic) 낮은 독성 (LD50=16g/kg, 소금, 설탕과 비슷 ) CS 의 유도체는 좋은 항 산화력을 가짐. =>CS 의 NPs 는 약물과 유전자 전달에 사용 적합. CS 는 amino group 때문에 산성조건에서 양성화되고, TPP 와 같은 음이 온으로 교차 결합할 수 있음. 교차연결을 통하여 CS NPs 준비가 단순하고 유연함.

Introduction 현재 연구에서 복합 CSNPs 는 이온결합법에 의해 합성됨. GM 과 SA 는 NPs 에 로드 됨. 복합 NPs 은 동시에 GM 과 SA 를 방출 할 수 있었고, 따라서 SA 의 길 항작용이 강화되었음. CSNPs 의 물리화학적 특성은 TEM, SEM, XRD FT-IR 과 같은 다양한 분석 기법을 이용하여 조사 되었고, 체내에서 약물 방출능 또한 조 사되었다.

Materials and methods 2.1. Materials CS(chitosan 95%, MW: 80KDa) GM(gentamicin) SA(salicylic acid) TPP(Tripolyphosphate) 기타 모든 재료는 analytical grade 사용

Materials and methods 2.2. Preparation of compound CS nanoparticles CSNPs 는 TPP 에 CS 가 이온가교 결합함을 기초로 하여 준비됨. 0.2% CS(in 1% acetic acid) at room temperature with sonication pH4.0~5.5 의 다양한 pH 의 CS solution 와 일정한 Volume 의 GM 과 SA solution 을 혼합 (GM:SA,1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5) CSNPs 는 TPP 용액이 dropwise 에 의해 혼합액에 첨가되었을 때 자 발적으로 형성. 선택된 질량비율 CS:TPP, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 NP 현탁액은 1 시간 동안 지속적으로 교반하고, 30 분 동안 16,000rpm 에서 원심분리함. 만들어진 NPs 는 동결건조및 저장됨.

Materials and methods 2.3. Characterization of GM/SA compound CS nanoparticles 2.2 에서 얻은 NPs 의 입자크기, zeta potential 과 PDI 는 photon correlation spectroscopy using nano ZS90 Zetasizer 에 의해 측정. Sample 은 적절한 농도의 탈이온수와 함께 준비 CSNPs 을 실은 약물의 표면형태는 TEM, SEM 으로 관찰 TEM- NPs solution 을 phosphotungstic acid 에 의해 천연적으로 염 색된 구리격자에 떨어뜨렸고, 실온에서 건조 SEM- NP 현탁액을 유리판에 분사하고 실온에서 건조. 건조된 NPs 는 진공하에서 금으로 코팅되면 검사 FT-IR - CS,GM, SA, drug-loaded NPs 의 화학구조와 복잡한 형성은 FT-IR 로분석 하였다. Sample 은 KBr 과 건조 표본을 분쇄하고 디스 크을 형성하기 위해 혼합분말을 누르는 것에 의해 준비 XRD- X-ray diffractometer 를 사용하여 수행. 5 도 ~40 도까지 스캔

Materials and methods 2.4. Determination of drugs loading capacity of nanoparticles GM 은 deoxystreptamine, purpurosamine and garamine 으로 구성 자외선 영역에서 특정한 흡수가 없음 GM 은 산성조건이나 PBS 내에서 aglycone and sugar 를 양적으로 가수분해 가수분해는 248nm 에서 UV spectrophotometry 로 분석 SA 는 297nm 에서 UV spectrophotometry 로 분석. 248nm 에서 SA 의 UV 흡수가 약하기 때문에 GM 의 양을 계산하기 위하여 다른 분광광도법을 사용. NPs 의 encapsulation efficiency (EE) 와 loading capacity (LC) 는 이 전의 연구에서 설명된 방법에 따라 결정

Materials and methods 2.4. Determination of drugs loading capacity of nanoparticles drug-loaded NPs(20mg) 을 상온 24 시간 동안 5ml 의 0.1mol HCl 로 추출하였고, NPs 현탄액을 16000rpm 에서 30 분 동안 원심분리하 였음. 상등액의 GM 과 SA 는 각각 248nm 와 297nm 에서 측정. Blank Sample 은 loaded drugs 없는 NPs 로부터 만들어졌고, drug- loaded NPs 와 동일하게 처리됨. 모든 Sample 은 3 회 측정됨. EE(encapsulation efficiency) 와 LC(loading capacity) 계산식 F: 상등액에서 GM or SA 의 free 양 T: GM or SA 의 총량 W: NPs 의 무게

Materials and methods 2.5. In vitro release studies vitro release 는 PBS(pH 7.4) 에서 수행. GM/SA loaded CSNPs(30mg) 와 5ml 의 PBS 를 투석 튜브로 옮기고, 투석튜브를 37 도씨 50ml PBS 에 넣고 100 stocks/min. 로 교반. 특정 시간 간격으로 매체는 fresh PBS 로 교체해줌. 세 Sample 은 각 시점에 분석. PBS 내로 방출된 GM 과 SA 의 농도 UV 분광광도법으로 결정

Results and discussion 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA 0.1% SA : 0.2%GM = 1.5 : 1, CSsolution pH=5.0 CS/TPP mass ratio 증가 -> EE, LC 감소, size 감소. 입자표면의 charge 강화 positive zeta potential -> amine group 에 의함.

Results and discussion 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA pH 증가 -> zeta potential 감소, CS 의 +charge 감소와 연관. particle size 증가, particle 응집 pH 4.0 에서 SA 의 LC 값이 높음 -> 용액의 pH 가 SA 의 pKa 에 가깝고, 낮은 PH 가 CS 의 양성화를 강화시킴 pH 5.0 에서 GM 의 LC 값이 높음 ->TPP 의 음이온과 CS 의 +charge 관련 cross-link reaction 을 강화

Results and discussion 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA drug-to-polymer ratio 감소 -> EE 증가, 입자크기 감소, zeta potential 증가, 높은 zeta potential 은 입자의 응집형성방지 drug-to-polymer ratio 1:4 ->LC 가 높음

Results and discussion 3.1. Preparation of CS nanoparticles containing GM and SA SA 비율 증가 -> SA 의 EE 감소 LC 증가 GM 의 LC 와 EE 는 반대 경향

Results and discussion 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles

Results and discussion 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles CS (A) SA/GM-loaded CS nanoparticles (B) gentamicin (C) and salicylic acid (D) GM/SA 가 CS nanoparticles 에 성공 적으로 load 됨.

Results and discussion 3.2. Characterization of GM/SA-loaded CS nanoparticles SA/GM-loaded CSNPs 는 peak 는 유지하나, 강도는 감소 18, 24 에서의 새로운 peak 발생. ionic interaction 에 의해 유도 SA (A) CS (B) GM (C) SA/GM-loaded CS nanoparticles(D)

Results and discussion 3.3. In vitro release studies of GM/SA-loading CS nanoparticles First phase : 4 시간 동안, 45% 의 SA, 38% 의 GM 이 방출, 급속한 방출과정은 초기에 NPs 표면의 약품이 쉽게 확산. Second phase : 4-12 시간, 약물이 매트릭스에서 확산, 87% SA, 81% GM 방출 Third phase : polymer degradation. 으로 더 느린방출과정, 녹은 약물이 방출 매제로 확산, 72 시간 동안 95% SA, 92% GM 방출

Results and discussion 3.3. In vitro release studies of GM/SA-loading CS nanoparticles

Conclusion GM/SA loaded CSNPs TPP 의 가교결합에 의해 성공적으로 준비됨. NPs 는 안정하고, 좁은 크기분포를 가진 구형임. GM and SA 의 entrapment efficiency 와 loading efficiency 는 GM and SA the mass ratio of CS to TPP, the drug to polymer ratio, the pH of CS solution, the feed ratio of SA to GM 로 얻을 수 있었다. 체외방출 연구는 SA 와 GM 의 비율이 GM 과 SA 의 방출 속도에 영 향을 준다는 것을 나타내었다. CSNPs 에서 SA 와 GM 의 방출량은 SA/GM loaded CSNPs 는 GM 의 이독성 길항작용에 효과가 있다는 것을 제안하였다.

감사합니다.