RNA isolation from monolayer cell using Trizol reagent 김예지 3rd Semester of Master’s degree Protein Biochemistry Lab (S301)

Introduction – Why do we study RNA? Nuclei DNA Pre-mRNA Transcription Splicing mRNA Ribosome peptide Translation Difference of Proteins → Difference of Gene expression… → Difference of mRNA !!!

Introduction: What is the difference between DNA and RNA? Can you spot the difference between ribose and deoxyribose?

Introduction – What is RT-PCR ? Downstream process after RNA isolation... rRNA : 80∼85% tRNA : 10∼15% mRNA`: 1∼5% (heterogenous in size, poly(A)tail) 1) RNA 분리 2) cDNA 합성: reverse transcription 3) PCR

Introduction –RNA analysis/different methods of RNA isolation 1. Northern hybridization - Size and amount of RNA 2. RT-PCR - Amount of RNA , cDNA synthesis 3. RNase protection assay - Amount of RNA and mutation detection Different ways of isolating RNA from monolayer of cells… Organic extraction method Spin basket format (Kit) Magnetic particle method Direct lysis method

Outline of RNA isolation Introduction – principle of RNA isolation Outline of RNA isolation 1.Cell Harvest 2.Addition of Trizol 3.Addition of Chloroform 4.Incubate at RT/Centrifuge 5. Addition of isopropyl alcohol/Incubate at RT 6.Centrifugation 7. Wash the RNA pallet with 75% ethanol 8. dry/dissolve RNA with DEPC-treated water 1. Controlling RNase activity - RNase inhibitors - RNase inactivation 2. Remove protein - Phenol/Chloroform 3. Separate RNA from DNA - Removal of DNA - Selection of poly(A) RNA

Materials - Cells - Huvec(Human umbilical vein endothelial cells) - HEK 293 T cells(Human embryonic kidney 293 transformed cells) - Trizol - Scraper - Chloroform(for RNA) - Isopropyl alcohol - RNase - free75% EtOH - RNase - free DW(DEPC - DW)

Procedure 실험중 RNase에 의한 RNA degradation을 막기위해 latex glove를 반드시 착용하며 말을 자제합니다. 1. Media를 제거 한 뒤에 PBS로 1회 washing 한다. PBS를 제거한 다음 1ml의 Trizol을 첨가한다(per 5-10 x 106 cells). 2. 단층 세포들을 scraper을 이용하여 긁어내고 lysate를 pipette을 이용하여 pipetting 해준다. (주의: scraper을 이용하여 세포를 긁어낼때 너무 많은 힘을 가하지 않는다.) 3. Cell lysate를 1.5ml tube로 옭긴후 5분간 실온에서 incubate 한다. 4. 0.2ml의 chloroform을 첨가한뒤 tube를 15초간 강하게 흔들어 준다. 5. 3분간 실온에서 incubate 해준다. 6. Sample을 14,000rpm에서 15분간 원심분리 한다. 7. 윗 층을 거두어 새로운 1.5ml tube에 담는다. 8. 0.5ml의 isopropyl alcohol을 넣고 상온에서 10분간 방치하여 RNA를 precipitate 한다. 9. 14,000rpm에서 10분간 원심분리 한다. 10. Supernatant를 제거하고 RNA pellet을 1ml의 차거운 75%에탄올로 washing 해준다. 11. RNA pellet 을 방치하여 에탄올을 말린다. (주의: RNA pallet이 완전 건조되지 않도록 한다.). 12 RNA를 DEPC-DW 로 녹인후 55-60 C 사이에서 10분간 incubate 한다.

Sample을1.5ml tube로 옭긴후 5분간 실온에서 incubate 한다. 단층 세포들을 scraper을 이용하여 긁어낸다.

tube를 15초간 강하게 흔들어 준다. 0.2ml의 chloroform을 첨가한다.

Sample을 14,000rpm에서 15분간 원심분리 한다. 3분간 실온에서 incubate 해준다. Aquose phase : RNA Interphase : DNA Organic phase (phenol/chloroform): Proteins,lipids

윗 층을 거두어 새로운 1.5ml tube에 담는다. 0.5ml의 isopropyl alcohol을 넣는다

상온에서 10분간 incubate하여 RNA를 precipitate 한다. 14,000rpm에서 10분간 원심분리 한다.

RNA pellet을 1ml의 차거운 75%에탄올로 washing 해준다. 14,000rpm에서 10분간 원심분리 한다.

Further study – discussion에 쓰세요!! Results 전기영동 결과를 보고 분리해낸 각각의 RNA band가 무엇을 나타내는지 추측해보시오. Further study – discussion에 쓰세요!! 1. DEPC는 무엇이며 어떻게 RNAse를 inactivate 시킵니까? 2. Trizol의 구성 물질은 무엇이며 그것의 기능은 무엇입니까? 3. 오늘 진행한 실험에서 Trizol과 chloroform, 그리고 isopropyl alcohol의 기능은 무엇입니까? 4. Monophasic phenol과 chloroform을 5:1 로 넣어주는 이유는? 5. RNA -> DNA -> PROTEINS,LIPIDS 로 나뉘는 이유는? 조교 : 김예지 010 – 9018 – 3822 freakangel@naver.com