물질의 회수와 정제 Recovery & purification of Bioproducts 분리 및 정제의 중요성 (Cost) Product Fermentation Purification Ethanol 1 0.16 Penicillin 1 1 Enzymes 1 2 Medical products 1 3 Recombinant proteins 1 4 ~ 9 전체론적 접근론(holistic approach) 발효 전 공정 및 발효공정이 발효 후 공정에 영향을 미침 발효 전 공정 및 발효공정은 발효 후 공정을 고려하여 설계 http://bioenv.sunchon.ac.kr

분리·정제의 고려사항 생산물의 축적 위치 : 세포 내, 외 생산물의 농도 (concentration) 생산물의 물리,화학적 특성 (physico-chemical property) 배양액의 특성 규모(scale) 원하는 순도(purity) 원하는 수율(yield) 비용(cost) 공정의 단순성(simplicity) 폐기물 처리(waste treatment) http://bioenv.sunchon.ac.kr

생물공정 생산물의 분리·정제가 어려운 이유 물질의 안정성(stability) - 물리·화학적 처리에 불안정함 - 효소에 의해 분해됨 - 배양액 중의 안정화 요소가 제거되면 불활성화됨 낮은 생산물 농도(low concentration) - 비타민 B12 : 0.06 g/L, 항생물질 : 0.2 ~ 60 g/L 아미노산 : 2 ~ 60 g/L, 재조합 단백질 : ? - 정제 초기 단계에서 농축이 필요함 - 농축 : 점성 증가, 거품 발생 부산물 생성(by-products) - 목적물질과 물리-화학적 특성이 유사한 부산물 : isomers - 독성 부산물 http://bioenv.sunchon.ac.kr

세포 내 물질(intracellular products) - 균체 파괴가 필요함 유기용매 사용이 어려움(수용액 사용) - 유기용매 : 단백질의 변성 고순도가 요구되는 물질이 많음 대규모 분리·정제에 사용할 수 있는 방법이 적음 폐기물 처리 - 유기물 함량이 높음

일반적인 분리·정제 과정 균체의 분리(separation of cells) 균체 파괴(disintergration of cells) - intracellular substances 3. 추출(extraction), 침전(precipitation) 4. 농축(concentration) 정제(purification) 조제(formulation) * 단위공정(unit process), 단위조작(unit operation) * 단위공정의 단계는 최소한으로 유지해야 함

다단정제과정의 수율 효과

균체의 분리(세포 수확) 고상/액상 분리 어려운 점 - 세포의 비중이 낮다 (Specific gravity of cells) 세균 세포의 비중 : 1.03 g/ml - 배양액의 점성이 높다 (High viscosity & stickiness) - Filter cake의 압축성 (Pressable filter cake) 분리 방법 선택시 고려 사항 - 세포의 크기와 모양 (단세포, 세포 덩어리, 균사체) - 배양액의 비중, 점도 - 배양액의 흐름 특성 (rheology, 유동학)

고형물 분리 방법 배양액 조절 - 여과(filtration) - 원심분리(centrifugation) - 침강(sedimentation) - 부유(floatation) 배양액 조절 - 침강, 원심분리, 여과, 부유 과정에 쉽게 이루어질 수 있도록 배양액을 처리 하여 미생물 또는 다른 현탁물질의 성질을 변형 - 응집(flocculation) 응결(coagulation)

여과(Filtration) 여과 Driving force = pressure 여과 효율 증가 방법 - 곰팡이, 방선균, 효모(응집성)에 사용 - 사용 불가 경우 (생물학적 안전성 측면) 독성 생산물, 병원균 유전자 재조합 미생물 및 그 생산물 Driving force = pressure - 여과 속도 : 여과 면적, 액체의 점도, 저항(flow resistance) - filter cake : compressible, 저항 증가, 제거 필요 여과 효율 증가 방법 - 전처리 : 희석, 가열, 응집 - 여과보조제 : 주로 규조토 사용

막여과기 (Membrane filter) * 균체분리에는 주로 Depth filter 사용 심층여과기 - 다공성의 매체(천, 유리섬유 또는 섬유소) 사용 - 압착여과기 (filter press) : 회분식 회전진공여과기 (rotary vacuum filter) : 연속식

압착여과기 회전진공여과기

박막여과기(membrane filter) = 절대여과기 (absolute filter) 미세여과(microfiltration) 병원균 또는 유전자재조합 미생물 처리 한외여과(ultrafiltration) 바이러스 분리, 단백질 정제, 물질의 분리와 농축 중공사(hollow-fiber) 역삼투(reverse osmosis) 높은 압력이 필요함 탈수, 농축, 바닷물의 탈염, 정수 http://bioenv.scbio.co.kr

중공사 한외여과기

침강(sedimentation) 사용 제한 사항 - 알코올성 음료 생산시 효모 분리 - 폐수처리 - 속도 느림 - 큰 덩어리인 경우에만 적합 : 응집 후 침전

침강속도 : Stoke’s law Vg : 입자의 침강속도 (m/s) Dp : 입자의 지름 (m) - 입자가 커야 함 (응집 후 침전) 입자와 배양액의 밀도차이가 커야 함 배양액의 점도가 낮아야 함 Vg : 입자의 침강속도 (m/s) Dp : 입자의 지름 (m) Ps, Pl : 입자, 액체의 밀도 (kg/m3) g : 중력가속도 (m/s2) η: 점도 (Pascal seconds, Pa s)

원심분리(Centrifugation) 여과보다 고비용 - 여과가 어려울 때 - 고도의 위생적 처리가 필요할 때 - 세균, 방선균 원심분리 속도 : Stoke’s law Vc : 원심분리 침강속도 (m/s) ω: 각속도 (radian/s) r : 거리(입자 – 축) (m) - 각속도(회전속도)가 빨라야 함 회전중심으로부터 거리가 커야 함

상대원심력(RCF, relative centrifugal force) - 원심력의 크기를 중력(g, gravity)의 배수로 표시 - - 원심력의 세기를 나타낼 때는 rpm 만으로 안됨 축과의 거리도 나타내야 함 * Svedburg unit (S) : 침강속도정수 예: 70S ribosome, 80S ribosome, 16S RNA, …

산업용 원심분리기 : 주로 연속형이 쓰임 관형(tubular bowl type) 분리판형(disc plate type) 산업용 원심분리기 : 주로 연속형이 쓰임 관형(tubular bowl type) 분리판형(disc plate type) 다공판벽 바구니형(perporated-bowl basket type) 다실형(multichamber type) …

세포의 파괴 For intracellular substances 미생물 세포의 파괴 : 강한 처리 필요 - 강한 세포벽(strength of cell wall) - 높은 삼투압(high osmotic pressure inside) - 작은 크기(small particle size) * 물질을 불활성화(inactivation) 시키지 않아야 함

- 물리적 처리 : blender, bead mill, high pressure homogenizer, 세포 파괴(파쇄) 방법 - 물리적 처리 : blender, bead mill, high pressure homogenizer, ultrasound(ultrasonicator), freeze-thaw * temperature control required - 화학적 처리 : enzyme, autolysis, chemicals, osmotic shock, phage

효소처리(Enzyme treatment) - Lysozyme, 달팽이 효소, 미생물성 세포벽 분해 효소 - 온화한 조건이나 고비용 - 다음 과정에 영향을 미칠 수 있음 : 불활성화 또는 제거 필요 자기소화(Autolysis) - pH, 온도 등을 조절하여 자기소화효소를 유도 - 시간이 걸림 : 물질의 불활성화 우려 삼투압차(Osmotic shock) - 동물세포의 파괴에 유리

화학물질 처리(Treatment with chemicals) - 계면활성제(detergents) : SDS, Tween, Triton, … 단백질 변성 가능성 - 알칼리 : pH 11.5 ~ 12.5, 30 min 물질에 강한 알칼리에 내성이 있어야 함 - 유기용매 : toluene, chloroform - 항생물질 : 세포 증식 중 penicillin 첨가

추출(Extraction) 추출 (Extraction) - 배양액(물)에 녹아있는 산물을 물 이외의 다른 용매로 이전시키는 조작 (liquid-liquid extraction) - 대부분 유기용매(organic solvent) 사용 ethyl acetate, butyl acetate, benzene, hexane, ether, butanol, … - 주로 항생물질, 지질 등에 사용 (단백질 : 변성으로 사용이 어려움)

추출용 용매의 조건 - 배양액과 혼합되지 않음 : 대부분 유기용매 사용 - 목적물질의 용해도가 높음 : 분배계수가 큼 - 목적물질을 선택적으로 용해시킴 - 배양액과 밀도 차이가 큼 - 에멀젼화가 잘 되지 않음 - 증발열이 적음 : 증류에 의한 회수 용이

같은 부피라면 여러 번으로 나누어 추출하는 것이 효율 높음 Single stage extraction Multistage estraction 같은 부피라면 여러 번으로 나누어 추출하는 것이 효율 높음 n회 추출 후 남아 있는 물질의 분율 연속 추출 (continuous extraction) Con-current extraction (순류추출) Counter-current extraction (역류추출)

수성 이상계 추출(aqueous two-phase extraction) - 유기용매 대신 친수성 고분자물질을 함유한 수용액으로 추출 dextran, polyethylene glycol 함유 수용액 사용 배양액에는 염(K3PO4, (NH4)2SO4) 첨가 - 주로 단백질 추출에 사용 온화한 조건에서 추출 가능 단백질의 변성에 의한 불활성화 방지 조작이 간단 : Scale-up이 쉽다

초임계 유체 추출(supercritical fluid extraction)

초임계 유체(supercritical fluid) - 특정 온도(Tc)와 압력(Pc) 이상에서는 물질이 액체도 기체도 - 초임계유체로 만들기 쉬운 것들 : 낮은 온도와 압력에서 CO2, N2O, C2H4, C2H6, CF3Cl - 초임계유체에서는 물질의 용해도(solubility)가 매우 높음 액체 또는 기체에 비해 104 ~ 109 X - 압력과 온도를 조절하면 초임계 유체의 특성 조절이 가능함 압력 증가 – 밀도 증가, 온도 증가 – 밀도 감소

초임계 유체 추출의 장점 - 농도가 낮은 물질 추출 가능 (ppm, ppb) - 추출(extraction) + 증류(distillation) 초임계 유체로 추출 후 압력을 낮추면 유체 기화 - 상온 정도에서 추출 : 열에 약한 물질의 추출 * 고가임

침전(Precipitation) 침전 석출 정제의 초기 단계에 주로 사용 - 고분자 물질의 농축 장·단점 배양액에 염 또는 용매를 첨가하여 산물의 용해도(solubility)를 낮추어 침전 정제의 초기 단계에 주로 사용 - 고분자 물질의 농축 장·단점 -간단하고 특별한 장치 불필요 - 많은 양을 처리할 수 있음 - 비용이 적다 - 순도 낮음 : 목적물질과 구조가 비슷한 물질이 같이 침전됨 불순물 제거 필요

용해도(solubility) 조절 방법 - 온도 - pH : 등전점 침전 - 이온강도(ionic strength) : 염석 - 유전상수(dielectric constant) : 유기용매 침전 - 화학반응(chemical reaction) : 불용성 침전물 형성 http://bioenv.scbio.co.kr

염석(Salting-out) Salting-in : 염의 첨가로 단백질의 용해도 증가 - 효소 등 고분자 단백질과 peptide류 - Ammonium sulfate((NH4)2SO4), Sodium sulfate(Na2SO4) - 단백질의 변성(denaturation) 없음 - 분별(fractionation) 가능 : 염농도 조절 - 침전 후 염 제거(desalting) 필요 : 투석(dialysis), 이온교환 크로마토그라피

등전점 침전(isoelectric precipitation) 아미노산 : Zwitter ion (양쪽성 이온)

등전점(pI, isoelectric point) - 단백질의 순전하(net charge)가 0인 pH (Side chain의 양전하의 합 = 음전하의 합) - 단백질은 등전점에서 용해도가 가장 낮음(침전 형성) - 배양액의 pH를 목적 단백질의 pI로 맞추어 침전시킴 * Isoelectric focusing

유기용매 침전, 화학반응 침전 유기용매 침전 화학반응 침전 - DNA 침전 : (cold) ethanol - 단백질 침전 : (cold) acetone 화학반응 침전 - Citric acid + CaCO3 ⇒ Calcium citrate(ppt.) - Xanthan gum, Alginate + Ca ⇒ Xanthan gum gel (ppt.) Ca-alginate (ppt.)

크로마토그라피(Chromatography) 주로 정제의 최종단계에서 사용 고정상(stationary phase) 이동상(mobile phase) 분배계수(distribution coefficient, D) 흡착(adsorption) 이온교환(ion exchange) 겔 여과(gel permeation) 친화(affinity)

기체-액체(gas-liquid chromatography, GC) 액체-액체(liquid chromatography, LC) 액체-고체(liquid-solid chromatography) Thin layer chromatography Paper chromatography Column chromatography Chromatogram Peak

정제산물의 농축 농축 (Concentration) - 정제 과정에서 사용된 용매 제거 정제 과정에서 사용된 (완충용액의) 염 제거 - 투석 (dialysis) 증류 (distillation) 결정화 (crystallization) 건조 (drying)

결정화(Crystallization) - 주로 아미노산, 유기산 등의 정제(purification) 목적 예) Citric acid (soluble in water)의 결정화 1) 수산칼슘으로 침전시킴 Citric acid in H2O + Ca(OH)2 ⇒ Calcium citrate (ppt.) 2) 여과한 후 황산 첨가 : 칼슘 제거 Ca-citrate + H2SO4 ⇒ Citric acid + CaSO4(ppt.) 3) 여과하여 황산칼슘 제거 후 증발 구연산 결정체 얻음

건조(Drying) 대부분 정제의 마지막 단계 수송비 절약, 취급과 포장 용이, 저장성 향상 열에 민감한 물질 : gentle drying required 건조 비용 절약 : 정제의 각 단계에서 최대한 수분 제거 필요 건조 방법 : contact, convection, radiation dry Drum dryer : contact dry, heat-resistant substances Spray dryer : convection dry no thermal damage (heat of evaporation) Freeze-dryer : sublimation drying, lyophilization at pressures lower than the triple-point of water (< 4 mm Hg) heat-sensitive substances

폐기물 처리(Waste treatment) 폐기물 처리의 필요성 conservation of environment recycle of water recovery of usable by-product law 발효 폐기물의 특성 독성 물질이 적다 유기물 함량이 높다 : 부영양화

BOD(biological oxygen demand) 용어 BOD(biological oxygen demand) COD(chemical oxygen demand) TOD(total oxygen demand) TS(total solids) DS(dissolved solids) SS(suspended solids) TOC(total organic carbon)