2. 세포 내막계 세포의 구획 필요성 세포에는 상존 불가능한 수많은 화학반응이 동시에 수행되고 있다. 특정 회로 관련 효소들 거대 단백질 복합체 구성 (원핵, 진핵 공통) 막 구조물로 구획 막성 세포소기관 분화 (진핵세포) 핵양체 1. 막성 세포소기관: 진핵세포의 막성 소기관과 진화 2. 단백질 분류 : 3가지 이동 기작, 신호서열, 핵 단백질, 미토콘드리아와 엽록체 단백질, 소포체 단백질과 막관통 단백질, 등의 합성과 이동 3. 소낭 수송 : 수송 소낭과 출아, SNARE에 의한 소낭 결합 특이성 4. 분비 경로 : 소포체와 골지체의 단백질 수식, 분비의 조절, 외포작용. 5. 내포작용 경로 : 식작용, 음작용, 내포작용, 리소좀과 세포내 소화
1. 막성 세포소기관 세포기관의 진화: 2 가지 진화 경로 최초의 진핵세포 전구체: 내막 구조가 없는 무기호흡성 원핵세포 원핵세포의 세포막: 전자전달, ATP합성, 지질 합성 등 기능 수행 - 진핵세포는 세균에 비해 1,000 -10,000 부피, 낮은 표면적 비. 확산에 의한 물질 수송의 한계: 내막계의 필요성 단계적 진화: 내막계의 형성, 세포내 공생 (1) 세포막의 함입에 의한 내막계 (endomembrane system) 형성 - 원시 원핵세포의 세포막이 막 결합 DNA와 함께 함입 DNA를 싸는 이중막 형성 핵 핵, 소포체, 골지체, 리소좀, 식포, 내포, 외분비낭 등 내막계 형성 핵의 외막은 리보솜 결합 RER에서 형성 세포 안팎 및 이들 소기관 간에는 소낭 수송에 의해 활발한 물질교환 소기관의 내막 층과 세포막 외 층의 유사성 현존 광합성세균에도 세포막 함입 현상이 있음.
(2) 미토콘드리아와 엽록체의 진화: 세포내 공생설 - 이들 소기관은 독자적인 DNA를 가지며, 구성 단백질 일부 합성 리보솜의 크기, 유전체의 모양, 내막의 전자전달 기능이 세균과 유사 이중막을 가지며, 소낭 수송에서 제외 - 원시 혐기성 세균이 호기성세균 및 광합성세균과 단계적 세포내 공생 호기성 세균: 미토콘드리아의 기원 광합성 세균: 엽록체의 기원
2. 단백질 분류 진핵세포 분열에서 막성 소기관의 분배 세포의 단백질 합성 : 2가지 경로 세포 소기관 단백질 이동 기작 막성 소기관은 기존의 소기관에서 유래, 간기 중 성장, 핵 분열 후 세포질 분열에서 두 딸세포로 배분 세포분열과정 중 핵막, 소포체, 골지체는 소낭으로 딸세포에 나누어 들어간 다음 융합 재생 소기관의 성장에서 단백질은 어디서 합성되어 어떻게 해당 소기관까지 정확히 이동하는가? 세포의 단백질 합성 : 2가지 경로 세포 소기관 단백질 이동 기작 (1) 핵: 핵공을 통한 능동수송 (2) 소포체, 미토콘드리아, 엽록체, 퍼옥시솜 : 단백질 전좌체 (3) 골지체, 리소좀, 외분비낭, 외포작용: 수송 소낭
신호가설 : 아미노산 신호 서열에 의한 세포내 구획간 단백질 운반 외분비 단백질의 합성경로: George Palade, 1974 : H3-Leu, Pulse label, Cold chase Autoradiography 17 min 100 min 신호가설 (Signal Hypotheis) : Günter Blobel & Bernhard Dobberstein, 1999 NPW, JCB 67:835-851,1975 골수종 (myeloma) 환자의 면역글로뷸린(IgG) 가벼운 사슬: mRNA의 암호 서열에 비하여 분비된 가벼운 사슬 N-말단 20여개 아미노산이 없어진 점에 의문 가설: N-말단의 이 특이 서열이 신호서열로 번역중인 리보솜이 소포체 막에 결합하게 한다. 합성 단백질은 소포체 내강, 골지체, 외분비 낭 등을 거쳐 분비됨을 규명 외분비 단백질은 아미노산 서열에 내장된 분류신호 (sorting signal)에 따라 이동한다는 신호가설을 제안.
: KDEL ER 분류신호: 15-60개의 아미노산 서열로 구성, *유전자 재조합 실험으로 입증 세포기질 단백질에 ER 신호서열 추가 ER로 이동 동일 소기관 단백질들간에 신호 서열의 다양성 아미노산 서열의 보존성보다, 전하성, 친수성, 극성 아미노산의 위치, 등 물리적 성질이 더 중요함을 시사 : 8개 정도 소수성 아미노산 : 양전하성 아미노산 서열 : 연속 양전하성 아미노산 서열 (KKKRK) : KDEL
(1) 핵공을 통한 핵 단백질의 이동 핵막 내막: 핵 기저층은 필라멘트성 염기성 단백질인 라민이 망상 구조를 이루어 핵막 지지 및 염색사와 결합 - 외막: ER과 연속, 구조적으로 유사. 핵공: 핵 단백질, RNA, ribosome 소단위체 등의 이동통로 핵공 복합체: 100여 개 단백질로 구성, RNA, 단백질 같은 거대분자는 적절한 분류신호 없이는 통과 불능 작은 수용성 분자가 이동할 수 있도록 물로 채워진 통로 포함 핵 단백질의 핵 위치신호 (nuclear localization signal): 짧은 연속 양전하성 아미노산 신호서열(-KKKRK-) 세포질의 핵 수송수용체가 핵단백질의 핵 위치신호 에 결합 <수용체-핵단백질 복합체>는 핵공 원섬유에 의해 핵공으로 유도 핵단백질이 핵공에 결합하면 핵공이 열리고, 수용체에 결합된 핵 단백질은 GTP 가수분해로 능동수송. 통과 후 수용체는 분리되어 세포기질로 이동. 단백질의 3차 구조가 유지된 채, 리보솜은 조립 완성된 상태로 이동
(2) 미토콘드리아와 엽록체 단백질의 이동 신호서열 (양전하성 아미노산 서열), 샤페론 단백질 (HSP70, HSP60)과 막 전위의 협조 NH2-말단의 신호서열을 통하여 외막의 수용체에 결합-단백질 복합체 형성 내, 외막이 만나는 특수부위로 측면 확산 3차 구조가 풀리면서 단백질 전좌체(translocator)에 의해 두 막을 가로질러 수송. 이 때 chaperone 단백질은 수송을 돕고, 수송이 끝난 단백질의 3차 구조 재형성에 관여 신호서열은 수송 후 signal peptidase에 의해 절단 안으로 들어간 다음 내, 외막 등 특정 부위로 수송되는 단백질에는 제2의 분류신호가 있으며, 이는 첫번째 신호서열이 제거된 후 노출 * 막 지질은 ER에서 합성된 후 지질 운반단백질에 의해 소기관에 운반.
(3) 타 소기관 단백질은 소포체에서 합성 수용성 단백질은 소포체 내부로 방출 세포막, 소포체, 골지체, 외분비낭, 리소좀으로 이동할 단백질 - ER 신호서열: 8개 정도의 소수성 아미노산 영역 수용성 단백질은 소포체 내부로 방출 N-말단 70여개 aa 중합하면 폴리펩티드가 리보솜 밖으로 신장되어 나옴 세포기질의 신호인지 입자 (signal recognition particle, SRP)가 폴리펩티드의 ER 신호서열에 결합 단백질 합성 중단 또는 속도 지연 <SRP-ER 신호서열 복합체> ER의 SRP receptor에 결합 SRP는 ER막에서 분리, 단백질 합성 재개 폴리펩티드 사슬이 ER막의 translocation channel을 통해 내강으로 이동 해독이 끝나면 신호서열이 signal peptidase에 의해서 절단되면서 내강으로 방출 (ER 내강 단백질, 외분비 단백질, 골지체 및 리소솜 내강 단백질, 등)
막관통 단백질은 소포체 막에 삽입 제2의 신호서열: 막 삽입 개시와 이동 종결 서열 (~ 20 소수성 aa, + 양전하성 aa as anchor) 막관통 단백질의 전좌과정 NH2-말단의 소수성 ER 신호서열에 의한 전좌 이동 종결 서열 (stop-transfer sequence)에 이르면 전좌채널을 빠져 나와 막에 고정 NH2-말단 신호서열 절단: NH2-말단은 소포체 내강을, COOH-말단은 세포 기질을 향함 막관통 단백질로 존재 막관통 단백질의 ER 신호서열이 단백질 내부에 존재 할 경우 ER 신호서열은 이동 개시 서열로 작용하지만 signal peptidase의 작용을 받지 않음 이동 종결 서열이 전좌 채널에 들어갈 때, 이 두 신호서열이 인지질 막으로 밀려나 2개의 -나선 막 관통영역이 됨 -나선이 여러 번 막을 관통하는 경우 이동 개시 서열과 종결서열이 여러 개 필요, 계속적인 시작과 종결로 여러 번 막을 관통
소포체에서 단백질의 공유결합에 의한 변형 단백질은 정확한 folding, 복합체 형성 여부를 확인, 이동, 그렇지 못한 것은 분해 Disulfide bond 형성 이동 중 pH변화나 분해에 대비, 단백질 구조 안정화 단백질 당화(glycosylation) 당 단백질 ER에서 단백질의 바른 folding 및 안정화 단백질 분류의 수송 신호로 작용 세포막 단백질은 glycocalyx를 구성 세포간 인지 표식 당화 과정 소포체 막의 특이 지질인 dolichol phosphate에 <14-oligo당: core CHO> 합성. 단백질의 전좌과정에서 특정 Asn (-Asn-X-Ser/Thr-)이 ER내강으로 들어오면 ER내막의 올리고당 전이효소에 의해서 올리고당이 Asn 측쇄에 결합 N-결합 배당체 형성
3. 소낭 수송 (Vesiclular Transport) ER에서 합성된 외분비 및 타 소기관 단백질은 수송 소낭 (transport vesicle)의 출아와 융합에 의해서 GA를 거쳐서 수송됨 수송 소낭은 막 구획간 단백질과 막을 운반 소낭 수송은 외분비 경로, 내포작용 경로 모두에서 이루어지며, 내포작용 경로에서 먼저 규명되었다.
단백질 외피 조립에 의한 소낭 출아 Clathrin : 출아하는 소낭 표면의 피복단백질 cargo receptor에 결합한 adaptin에 결합하며, 막의 구조변화 야기, 소낭 출아 유도 피복구(coated pit) 피복소낭(coated vesicle) 형성 분비 경로: ER에서 출아 GA lysosome/외분비낭 내포작용: PM에서 출아 내포 (endosome) COP: coat protein 내포작용에서 피복소낭 (coated vesicle) 형성 과정 수용체(R)와 운반분자(Ligand) 결합 측면이동 수용체에 adaptin 결합 clathrin 결합 GTP결합 단백질인 dynamin이 피복구의 목부위에 고리 모양 조립 GTP 가수분해 dynamin 수축 피복소낭 피복분리 수송소낭
소낭 결합특이성 결정: SNAREs 각 수송 소낭 막에는 특이 지표 단백질인 v-SNARE, 표적막에는 상보적인 수용체 단백질인 t-SNARE SNARE : SNAP Receptor SNAP : soluble NSF attachment protein NSF : NEM(N-ethylmaleimide) sensitive fusion protein SNARE : NEM민감성 융합단백질의 부착단백질 수용체 SNARE에 의한 융합 기작 수송 소낭과 표적막의 SNARE간 인식 및 결합 특정신호 전달 두 막이 1.5 nm이내로 근접 융합 단백질의 결합으로 융합복합체를 형성 융합과 내용물 전달
4. 분비 경로 (Secretory Pathway) 외포작용 (Exocytosis) 단백질, CHO, 지질분자가 ER에서 PM밖으로 분비되는 경로 (secretory pathway) 이 과정 중 각 분자에 화학적 변형이 일어나면서 막성 소기관을 순서대로 통과 소포체에서 단백질의 질 관리 ER 상주 단백질: COOH- 말단에 4개 aa의 ER 잔류신호 (ER retention signal: KDEL) 이 신호가 ER, GA의 수용체에 인식되어 ER에 남게 됨. 대부분 단백질은 수송 소낭에 의해 GA로 이동. 적절히 folding되지 못하거나, 이중체, 다중체 형태를 이루지 못하면 Chaperone 단백질과 결합, 적절히 folding될 때까지 이동억제, 또는 분해 예: 항체: 4 polypeptides로 구성 예: 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) : 유전적 변이에 의해 특정 PM 수송단백질의 folding 이상으로, 단백질이 ER 내에 축적 기능적으로 불완전한 세포형성
골지체에서 단백질의 변형과 분류 GA: 세포중심(핵, 중심체)에 위치, 다중 엽(cisternae) 구조 cis-cisternae (유입되는 면, ER 쪽), medial cisternae, trans-cisternae (배출면, PM 쪽) 단백질은 ER 유래 수송 소낭을 통해 cis-GA로 유입된 다음 cisternae간 소낭 수송 trans-cisternae에서 수송 소낭에 의해 PM, 또는 다른 소기관으로 이동 Cisternae를 거치면서 배당체 수식(올리고 당의 부분 분해, 단당 첨가) 및 인산화 단백질의 Ser/Thr에 O-결합 배당체 형성 단백질의 소낭 분류는 trans-GA에서 acidic pH, 고농도 칼슘 등의 특수 환경으로 200x 고농도로 응집, 농축 포장 특정 자극에 따라 많은 단백질을 신속히 분비할 수 있도록 함 골지체 특이 형광 항체 염색
외포작용에 의한 분비 상시 외포작용 (constitutive exocytosis): 소낭이 수시로 trans-GA에서 돌출, PM에 융합, 단백질과 지질을 PM 막에 공급 또는 분비 조절 외포작용 (regulated exocytosis): 분비를 위해 특수화된 세포에서만 작동 호르몬, 점액, 소화효소 등 특정 생산물 합성 분비소낭 (secretory vesicle) 저장 외부자극이 있을 경우 신호전달로 PM과 융합, 배출 예: -cell의 혈당량 증가에 따른 insulin 분비
5. 내포작용 경로 (Endocytic Pathway ) 식세포에 의한 거대 입자 섭취 원생동물의 식세포 작용: 세균 등 거대입자 포획, phagosome형성 lysosome 융합 소화 식세포 (Phagocytic cells): 대식세포 (macrophage) 등; 감염 미생물 섭취, 소화로 감염에 대한 일차 방어작용 항체가 결합된 세균입자가 식세포 표면 수용체에 결합 위족(pseudopod)을 내어 포식 PM의 융합에 의해 식포 형성 죽은 세포, 손상된 세포, 세포단편을 청소: 대식세포는 매일 수명을 다한 RBC 1011개(천억) 이상 섭취 음작용(Pinocytosis) : 액체와 거대 분자 진핵세포는 음세포 소낭(pinocytic vesicle) 형태로 액체를 끊임없이 섭취 : 선별 특성 미약 macrophage 매시간 자신의 부피의 25% 에 해당하는 액체 섭취 = 분당 원형질막의 3%, 30분에 전체 100%를 섭취. Fibroblast 낮은 비율 Amoeba 빠른 속도로 원형질막 섭취
특정 분자를 위한 수용체 매개 내포작용 (Receptor mediated endocytosis) 거대분자를 선택적으로 세포 외액에서 섭취 거대분자는 세포표면의 수용체에 결합, 수용체-거대분자 복합체 형성 clathrin-coated vesicle을 이루어 세포내로 들어옴 특정 거대분자를 1000X 효율로 세포 내로 유입 ① 콜레스테롤의 수용체에 의한 내포작용: Brown and Goldstein, 1986 NPW 콜레스테롤은 혈장의 특정단백질과 결합 저밀도 지방단백질 (low density lipoprotein, LDL) 입자 LDL이 receptor에 결합 receptor-LDL 복합체 수용체 매개 내포작용 피복소낭 내포 내포막의 H+-펌프 작동, 내부 산성화 수용체로부터 LDL 분리 수용체는 transport vesicle을 통해 PM으로 재순환 LDL은 리소솜으로 이동, 가수분해효소에 의해 분해 유리된 콜레스테롤은 세포기질로 방출, 새로운 막 형성에 사용됨 결함이 있는 경우: 선천성 고혈압 수용체 결함 타 내포작용 관련 요소의 작동 부진 콜레스테롤 혈액 축적 동맥경화 ② Vitamin B12, 철분, 난황, 신호전달 물질, 독감 바이러스 등
내포 (endosomes)에서 거대 분자의 분류 수용체와 수용체에 결합된 물질의 분리 수용체는 PM으로 복귀, 일부 수용체는 세포기질로 이동, 분해 다른 부류의 수용체는 반대쪽 PM에 전달; 한쪽 세포외 공간의 물질이 반대쪽 공간으로 이동 세포통과 (transcytosis) 수용체에 결합한 분자는 수용체와 분리된 후, 리소솜으로 이동, 분해됨
리소좀과 세포내 소화 . - 리소좀: 40여종의 가수분해효소 보유, 최적 pH~5 ATP-dependant H+ 펌프로 산성유지 세포기질(pH7.2), 세포 밖(pH7.4)으로 방출되더라도 최적 pH 범위 이탈로 손상 최소화 이 효소 단백질은 ER cis-GA에서 mannose-6-phosphate로 표지 trans-GA에 도달 <M-6-P>수용체 인식 수송 소낭에 의해 리소좀에 운반 . 세포내 소화 식포 lysosome 융합 endosome 리소좀과 융합. 세포 자신의 노화부분: 자가포식(autophage) 자가포식소낭 (autophagosome) 형성 리소좀 융합