FACSAria의 원리와 응용 서울대학교 기초과학공동기기원 연구원 / 노 혜 진

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) : 형광물질로 표지된 활성화 된 세포를 분리하는 기기 1. FACS의 기본 구조, 기능 2. 세포의 정의 3. 세포의 구조 및 종류 4. Sample 준비 과정 Overview 5. FACSAriaⅡ를 이용한 Sorting 6. FACS를 이용한 연구활용분야

1. FACS의 기본 구조 및 기능 Subsystems Fluidics (유체공학) To introduce and focus the cells for interrogation and create a stable breakoff for sorting Optics (광학) To generate and collect the light signals Electronics (전자공학) To convert the optical signals to proportional digital signals, process the signals, and communicate with the computer

Sorting 2. Charge is applied via the stream-charging wire. 1. Sample generates light scatter and fluorescent signals; signals are analyzed. 3. Charged droplets break off. 4. Deflection plates attract or repel charged droplet. 5. Uncharged droplets pass to waste. 6. Charged drops containing particles of interest are collected.

Fluidics Sheath Flow Sample Flow sample tube pressurized sheath tank sheath filter sample tube sample injection chamber sample collection chamber collection tube or plate pinch valve cuvette flow cell waste aspirator interrogation point

Drop Formation Amplitude Frequency Drop 1 Gap Adjusts the intensity of the drop drive Frequency Determines the number of drops formed per second Drop 1 Number of pixels from the top of the image to the center of the first disconnected drop Gap Number of pixels between the stream breakoff and the first drop

Optics Excitation optics consist of: Lasers Fiber optic cables that carry beams to steering prisms, which then direct laser beams to the fluid stream Collection optics consist of: Fiber optic cables that direct the emitted light to the appropriate emission block Filters that direct the signals in the emission block to the appropriate photomultiplier tube (PMT)

※ 여기서 잠깐! • 자외선 • 가시광선 • 적외선 - 가시광선보다 파장이 짧은 전자기파 가시광선 중 보라색이 가장 짧은 파장을 가지므로 보라색의 바깥쪽에 있다는 의미로 자외선이라고 부름 • 가시광선 - 눈에 보이는 광선 - 무지개를 볼때 보이는 빨강, 주황, 노랑, 파랑, 보라의 색이 가시광선에 의해 보임 - 380~770 nm의 파장 구장을 가짐 • 적외선 - 가시광선보다 파장이 긴 전자기파 가시광선 중 빨강색이 가장 긴 파장을 가지므로 빨강색의 바깥쪽에 있다는 의미로 적외선이라고 부름

Excitation Optics Laser Wavelength Min. Power Commonly Used Fluorochromes (nm) (mW) or Dyes Blue 488 nm 13 FITC, PE, PE-TxRed, PE-Cy7, PerCP, PerCP-Cy5.5, PI Red 633 nm 11 APC, APC-Cy7 Violet 405 nm 30 Alexa Fluor430, Pacific Blue, Cascade Blue, DAPI Near UV 375 nm 7 Hoechst, DAPI, Cascade Blue, Pacific Blue

Excitation Optics fiber optics prisms

Collection Optics

violet or near UV laser signal Collection Optics Trigons Octagon violet or near UV laser signal red laser signal blue laser signal

Electronics Converts analog signals to proportional digital signals Computes area and height for each pulse Performs compensation, calculates ratios, and calculates width Interfaces with the computer for data transfer Performs sorting decisions, including gating, conflict resolution, and drop charging

2. 세포의 정의 1) 세포의 발견과 세포설의 유래 : 세포(cell)란 모든 생명체의 기능적, 구조적 기본 단위이다. ① 세포의 발견 ② 세포설 : 1665년 영국의 로버트 훅이 코르크조각에서 세포(벽)를 발견 - 1838년 슐라이덴 : “새로운 세포는 이전의 세포로부터 생겨난다.” - 1839년 슈반 : “생물은 모두 세포로 만들어진다.” (세포설) - 1855년 피르호 : “모든 세포는 세포로부터 만들어진다.”

3. 세포의 구조 및 종류 1) 세포의 기본 구조 ① 세포의 크기 ② 식물 세포와 동물 세포 : 세포의 모양과 크기는 기능에 따라 매우 다양 ② 식물 세포와 동물 세포 공통점 ① 세포막에 의해 둘러싸여 있다. ② 둥근 핵과 세포질로 이루어져 있다. ③ 동일한 세포 소기관 차이점 ① 식물세포에는 세포벽, 엽록체, 액포가 있다. ② 동물세포에는 중심체가 있다.

2) 면역세포 (Immune cell) ① 면역이란? : 생체에 침입한 병원균이나 독소에 저항하여 이겨내는 힘 ※ 여기서 잠깐! 항원(Antigen) : 면역 반응을 일으켜 특히 항체를 생산하게끔 만드는 물질로서 일반적으로 생명체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체, 외부로부터 침입한 물질. 항체(Antibody) : 항원에 대항하기 위해 혈액에서 생성된 당단백질, 항원에 저항하기 위해 생겨난 내부 물질. ☞ 대표적인 예 : ABO 혈액형

② 면역활동 • 면역활동을 하는 성분의 종류 - 림프조직 : 면역활동을 하는 성분이 분비되는 곳 (인체의 군대 같은 조직) - 마이크로퍼지 : 대식세포 혹은 탐식세포라고 불림, 세균 뿐 아니라 고름까지 먹음 백혈구의 호중구 : 세균 등 이물질로 배를 채우다가 더 이상 먹을 수 없을 정도가 되면 바로 죽어 버림 - 림프구 : 가장 강력한 전투력을 갖춘 부대, 골수와 흉선에서 만들어짐(B림프구, T림프구) - NK 세포 : 체내의 암세포를 포위해서 죽이는 임무 - 보체 : 항체의 활동을 돕는 것

• B 세포 (Bone marrow cell) - 면역계를 구성하는 주요한 세포 (B cell, T cell, NK cell) ③ 면역세포 – 림프구(Lymphocytes) 항원의 침입을 인식하여 활성화되어 항원을 제거하는 작용을 하며 이때 림프구는 특정항원과 특이적으로 반응한다. • B 세포 (Bone marrow cell) - 골수에서 만들어지며 항체를 생산 • T 세포 (Thymus cell) • 헬퍼 T세포 : 면역반응을 촉진 • 서프레서 T세포 : 면역반응을 억제 • 킬러 T세포 : 외부침입자를 직접 공격, 파괴 - 골수의 전구세포가 흉선에서 성숙되어 만들어짐

• NK 세포 (Natural Killer cell) - 골수에서 만들어지며 선천 면역 반응에서 암세포나 바이러스에 감염된 세포를 죽임 ※ 세포 구별법 세포 표면에 있는 막 단백질에 대한 항체를 이용하여 막 단백질의 종류를 조사하는 방법으로 각각을 구분 CD (cluster of differentiation) : 면역세포들이 세포 표면에 가지고 있는 표면의 분자구조인 표현형 marker Ex) T cell (Thymus) cell CD4 CD8

T cell development cell DN DP (Double Negative) (Double Positive) SP (Single Positive)

④ 면역반응 • 서로 도와 항체를 만든다 – 체액성 면역 - 체액성 면역 : B세포와 T세포가 힘을 합쳐 물리치는 면역반응 우리 몸에서 면역을 담당하는 곳 : 골수(Bone marrow), 흉선(Thymus), 림프절(Lymph node), 지라(Spleen) 등 - 면역기능을 담당하는 림프구 : B cell, T cell B cell ☞ Bone marrow(골수) T cell ☞ Thymus (흉선) 체액성 면역 : B세포가 항원을 인식해서 보조 T세포의 도움을 받아 항체를 대량 생산하고 또 세포 밖으로 분비, 분비된 항체는 체액에 의해 온몸으로 운반되어 항원과 결합하여 작용

• 잡히면 없애 버린다 – 세포성 면역 세포성 면역 ① 자연 살해 세포 (Nutural Killer cell) : 체내에 암세포나 바이러스에 감염된 세포를 포위해서 죽이는 임무 ② 살해 T 세포 : 바이러스에 감염된 세포나 암세포가 발견되면 분열을 통해 동료 T세포를 증가 시킨 뒤 세포를 죽이는 임무 : HIV라는 바이러스에 의해 T세포가 파괴되는 바람에 면역계 반응이 정지되어 버린 경우 ※ 후천성 면역 결핍증 (AIDS)

4. Sample 준비 과정 1) Mouse 해부

2) Single cell PBS 용액을 넣어 슬라이드글라스로 Single cell을 만든다 ※ PBS 용액을 넣는 이유 - 이온 농도 조절 : 세포가 삼투막으로 되어있기 때문에 세포의 수축, 팽창으로 인해 세포가 파괴 될 위험

cell Surface marker Antibody 형광물질 3) Staining ※ 형광물질의 종류

5. FACSAriaⅡ를 이용한 Sorting 1. Isolate spleen from the mouse Foxp3gfp mouse on C57BL/6 background 2. Mechanically smear into single cells 3. Fluorescence-conjugated FACS antibody staining 4. Suspend the cells in PBS Workflow of regulatory CD4+ T cell Isolation By using FACSAria II CD4+ nTreg : GFP+CD4+ Naïve T : CD62L+CD4+

FACSAria Operating - FACSDiva software

Before sorting After sorting nTreg cells (purity > 97%) naïve CD4+ T cells (purity > 99.1%) After sorting

6. FACS를 이용한 연구활용분야 생명과학, 약학, 생화학, 수의학 등에 많이 사용되며 주로 면역학 연구를 위한 과학장비 순도 높은 목적세포를 분리해 낼 수 있으며, 이렇게 분리된 목적세포의 기능에 대한 정확한 이해를 가능케 함. 세포분리를 통해 자가면역질환, 암, 염증반응, 줄기세포분화 등에 대한 연구를 진행