제14장 고정화 효소 Chemical Eng. 生物化工 Dong-A Uni. 0238708 문창민

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고정화효소의 장,단점 고정화효소 고정화 효소 고정화 효소란? 효소를 화학, 물리적 방법으로 불용성 담체에 고정하여 이동성을 제한하는 것 비용 절감 연속반응기 사용가능 외부조건변화에 대한 민감성 감소 효소반응의 효율성 저하 효소 작용 부위가 불활성 될수 있음

1. 고정화 효소 제조법 1 . 흡 착 효소가 반데르발스 힘 또는 분산력과 같은 약한 물리적 힘에 의해 지지 입자의 표면에 부착하는 것 (표면 고정화) S P 지 입 자 E

1. 고정화 효소 제조법 2. 겔 격자층에의 포괄법과 켑슐화 ( 가두기법 ) 포괄법 캡슐화 S E P E 포괄법 : 중합체로 망상 구조를 만들고 효소를 이 중합체 안에 가두는 방법 캡술화 : 미세하면서 속이 빈 다공성막으로 구를 만들어 효소액을 내부에 담는 방법 E S E P 포괄법 캡슐화

1. 고정화 효소 제조법 3. 분자사이의 가교 효소와 글루타르알데히드(glutaraldegyde) 등 저분자량 물질을 공유결합시켜 가교를 형성하는 방법 즉, 효소와 담체사이, 혹은 효소분자들 사이에 가교반응이 일어나 효소가 막 위에 고정화 되는 방법 효소 -NH2 , -OH기가 관여 실리카겔입자

1. 고정화 효소 제조법 4. 공유결합 효소를 공유결합에 의해 지지물질의 표면에 부착시키는 방법 공유결합에 적합한 관능기 α- 및 є - 아미노기(-NH2) α,β 및 γ- 카르복실기(-COOH) Cysteine의 –SH기 및 Serine의 -OH기 Histidine의 imidazole기(-C3H4N2) Tyosine의 Phenol ring

1. 고정화 효소 제조법 4. 공유결합 효소(트립신)와 에틸렌과 무수말레인산의 1:1 공중합체로 공유결합한 상태

2. 고정화 효소의 반응속도론 1 . 고정화된 효소체계의 역학적 반응의 영향에 대한 일반적 사항 고정화효소의 반응은 담체표면에 경계층으로 가정함 본장에서는 비다공성 물질에 결합한 효소계만 취급 (다공성 담체사용계는 논외적인 공내에 의한 물질이동을 논해야함.)

2. 고정화 효소의 반응속도론 기질의 유속 Jd So – Si Δl Jd = -D grad S Jd = D (14·1) So – Si Δl 한방향의 확산으로 가정, Jd = D (14·2) D = 기질의 분자 확산계수 So = 액본체의 기질농도 Si = 효소표면의 기질농도

2. 고정화 효소의 반응속도론 정전기력에 의한 기질의 유속 Je ψ= 정전기적 포텐셜 3πμd u = en( -grad ψ) RT DN Je So Je = So u Nernst-Einstein식 N x e = F (파라데이상수) Je = - n So grad ψ RT DF (14·3) ψ= 정전기적 포텐셜 d = 기질분자의 직경 n = 전기화학당량 u = 기질분자의 선속도

2. 고정화 효소의 반응속도론 효소표면의 반응속도 v - dSi dt VmaxSi Km + Si v = vsa = = Michaelis - Menten식에 의해 - dSi dt VmaxSi Km + Si v = vsa = = (14·4) vs = 고정화효소 단위표면적당의 반응속도 a = 고정화효소 단위체적당의 표면적 vs = Jd + Je 정상상태에 있어서 (14·5) Vmax′St Km + St So – Si Δl RT DF = D - n So grad ψ (14·6) 단, Vmax′= Vmax / a 이다.

2. 고정화 효소의 반응속도론 효소표면의 반응속도 v vs2 - αvs + β = 0 식을 간단히 하면 vs2 - αvs + β = 0 (14·9) D Δl (Δl) Vmax′ D n(Δl) RT α = { Km + S0 + - F S0 grad ψ} Vmax′ Δl n(Δl) RT β = DS0{ 1 - F S0grad ψ}

2. 고정화 효소의 반응속도론 효소표면의 반응속도 v vs = β/α = = Km′= { Km + } { } V를 구하면 근사해는 α-β/α 또는 β/α이지만 전자는 Δl 가 0에 접근함에 따라 Vs값이 무한대가 되기 때문에 부정 Vmax′ Δl n(Δl) RT DS0 { 1 - F S0grad ψ} vs = β/α = D Δl (Δl) Vmax′ D n(Δl) RT { Km + S0 + - F S0 grad ψ} Vmax′S0 S0 + Km′ (14·10) = (Δl) Vmax′ D RT RT - n(Δl) F grad ψ Km′= { Km + } { } (14·11)

2. 고정화 효소의 반응속도론 1.1 Km 및 Km′ Km ′값은 이온강도가 낮은 경우 원래의 트립신에 대한 Km 보다 아주 작음 이온강도가 증가하면 Km ′값은 트립신의 값과 거의 같다.

2. 고정화 효소의 반응속도론 1.2 pH Jd + Je = 0 DF - D grad CHi+ - CHi+ grad ψ = 0 가정 – 고정화효소의 구조 내부의 수소이온 농도는 무시. 즉, 표면 부근과 액 본체에 의한 농도만 고려. 정상상태. Jd + Je = 0 (14·12) RT DF - D grad CHi+ - CHi+ grad ψ = 0 (14·13) CH+ = CHi+ ψ = 0 이라는 조건 하에 CHi+ 를 정리하여 풀고 CH+ ≈ aH+ 라 가정하면 pH = -log aH+ 에 의해 RT F ΔpH = pHi - pH = 0.43 ψ (14·16) ΔpH = 고정화효소표면과 액 본체의 pH차 pHi = 고정화효소표면의 pH CHi+ = 다가 이온 담체표면에 의한 수소이온농도 aH+ = 수소이온의 활성량

2. 고정화 효소의 반응속도론 1.2 pH

2. 고정화 효소의 반응속도론 1.3 온도 및 기타의 인자 열저항성 증대 본래 효소 : 70℃, 15분 가열에 의해 활성을 잃음 고정화효소 : 동일처리후에도 원래 활성이 잔존 그림 14.7

2. 고정화 효소의 반응속도론 1.3 온도 및 기타의 인자 열저항성 증대 36~ 70℃사이에서 반응 36℃에서 활성을 100%라 둔다. 온도에 의한 활성 증가 그림 14.8

2. 고정화 효소의 반응속도론 2.1 공간속도(Space velocity) γ = 비례상수 가정 – 기질용액이 고정화 효소를 충전한 컬럼을 F 의 속도로 통과 액 본체의 기질농도 와 효소표면에 의한 기질농도 가 직선관계 γ = 비례상수 (14·17) (14·18) 17식을 18식에 대입 (14·19)

2. 고정화 효소의 반응속도론 2.1 공간속도(Space velocity) 단, 19식을 적분 (14·20) 충전층의 공극률 충전층의 단면적 충전층의 길이 공간속도

2. 고정화 효소의 반응속도론 2.1 공간속도(Space velocity) (14·20) 가수분해율 을 도입 (14·21) 가수분해율 을 도입 (14·21) (14·22)

2. 고정화 효소의 반응속도론 2.1 공간속도(Space velocity) 조건 50°C , 고정화 aminoacylase의 충전층을 이용 2.303Km ′ 공간속도Vs 증가 --기울기(Km ′)감소 Acetyl-DL-methionine가수분해 반응 실험결과

2. 고정화 효소의 반응속도론 2.2 유체의 압력손실 압력손실은 Kozeny-Carman식을 따름 압력손실 충전층의 공극률 기질 용액 압력손실은 Kozeny-Carman식을 따름 압력손실 충전층의 공극률 중력환산계수 액의 선속도 액의 점도 Kozeny-Carman정수 충전층의 길이 고정화효소의 진밀도 고정화효소의 단위중량당의 표면적

2. 고정화 효소의 반응속도론 2.3 안정성 1회분당 효소의 손실률 담체의 질량 회분당의 효소 손실량 전효소량 용액의 체적 Kozeny-Carman정수 회분당의 용액배출률 담체중의 효소농도 용액중의 효소농도

3. 고정화 효소의 응용 예 3.1 의료 인체에 축적되는 물질을 제거하여 질병을 예방 문제점 : 장기간 고정화 효소의 인체내 유입시 정보 부족 질병에 관한 분자 메커니즘의 정보 부족 응용의 예 선천적 대사질병 치료 - 특정효소의 결함을 치료 목적으로 효소투여 효소를 마이크로캡슐, 겔안쪽에 격리시켜서 항체의 공격을 받지 않고 기능을 수행 인공신장 - 우레아제(urease) 효소 : 흡착제인 수지, 탄(charcoal) 이 함께 캡슐화 우레아의 분해로 생성되는 암모니아를 마이크로 캡슐에 흡착 임신 진단 키트

3. 고정화 효소의 응용 예 3.2 효소센서 생체 관련물질을 막에 고정화하여 전기화학장치에 연결시킨 장치 바이오센서란? 생체 관련물질을 막에 고정화하여 전기화학장치에 연결시킨 장치 분석하고자 하는 시료를 생체촉매에 흡착하여 복합체를 형성한 다음 일어나는 상호화학, 전기화학반응 등에 의하여 형성되는 전자 또는 전류, 가스, 수소 이온농도, 열 등을 물리적 신호로 전환시킨 다음, 증폭장치를 통해 확대시켜 기록계, 검출기 등에 의하여 정량할 수 있도록 만들어진 장치

3. 고정화 효소의 응용 예 3.2 화학분석 (효소전극) 클루코스와 산소 투과 glucose oxidase ①고정화시킨 acrylamide 겔층에 클루코스와 산소 투과 ②포도당 + 산소 glucose oxidase 글루콘산 + 과산화수소 ③산소농도의 감소를 산소전극으로 측정 그림 14.11 (a)

3. 고정화 효소의 응용 예 3.3 공업에의 응용 기타 고정화된 포도당 이성화 효소 (glucose isomerase) 생체반응기 고정화 효소를 이용하여 효소반응을 연속적으로 일으키도록 만든 장치 고정화된 포도당 이성화 효소 (glucose isomerase) 전분을 가수분해 하여 얻은 포도당을 과당으로 전환 고정화 아미노엑시라아제 (aminoacylase) - 아세틸아미노산의 DL-라세미 화합물을 분리