DNA microarray를 이용한 유전자 differential expression 정량측정 실험 생명과학 /바이오 융합 연계전공 20050831 한다혜

Out line Abstract Method & Theory Data & discussion Result Reference Central dogma ,DNA 구조, PCR, hybridization Data & discussion Result Reference

실험 목적 실험 개요 DNA chip Sample Hybridization → 형광 발현 High-througtout 방법인 DNA chip을 이용하여 조건에 따라 달리 발현되는 세포 내 유전자상의 DNA조각들을 일정한 간격으로 붙이고 형광물질로 표지 한 유전자 cDNA (RNA) or DNA의 hybridization을 통해 발현 양상을 정량적으로 분석 실험 개요 DNA chip Sample Hybridization → 형광 발현

실험방법 DNA Chip 제작 Sample 제작 RNA 추출 Reverse transcription Primer 설계 좋은 primer의 조건 PCR Electrophoresis Purification Elution chip 제작 RNA 추출 Purification Reverse transcription Amino Allyl Labeling Cy3/ Cy5

DNA chip 제작 DNA 추출과 primer제작 병원성 유전자 - S. typ, S. flex, E. coli, V. vul, V.cho, V. par Primer 설계 - 좋은 primer 의 조건 앞/ 뒤 primer의 Tm값 비슷하게 GC의 함유량은 40~60% Self complimentary, hetero dimer 생성 방지

ATG GAT TTG CGC ATT AGC GG 56.5 CAG TGA CAT TCG AGG TCT GC 55.7 250 1 FlgE ATG GAT TTG CGC ATT AGC GG 56.5 CAG TGA CAT TCG AGG TCT GC 55.7 250 2 VenB ATG CCA TCG CGG ATT TTA CT 54.9 CCA TTT TTC CAC CAA CAC CA 53.7 251 3 FliP ACT TCT GAC CAC GTT TTG GC 55.9 AGT AGT CTT CAC TGC CGT CA 55.5 236 4 Wzb TGA GCG TGT GCT ACA AAA A 52.5 GTT AGT GCT TCC ATA TGG C 50.8 228 5 hemolysin CAG TCA ATA TAG TGT GCG CG GCA CTG TGG TCA AAG GTT TT 53.9 246 6 RtxA GTA AAA TCA GAG CGA GAG CC 53.3 CTG ATG CTC AAC GGC AAT AT 53.1 249 7 VvhA CAA AGT AGG CGC GGA AGT GA 57.7 CAA ATA CCC AAC CAC TGC CC 245 8 VvhB TGC TGT TTG TTT GCG GCG AA 58.8 GCG TCG TCA CCA GCA ATT TG 57.4 248 9 VvhD TGA ACG CGG CGT GCT TAA TG 58.9 GCG GCG ATC AAC ACC AAA GT 58.7 244 10 VvhE-1 GTC GAT GCC CAT TTC TTT GC GTC GGT CAA TCC GTG TGA AA 55.3 11 VvhE-2 GAT TCA ACT GCC GAA TGG CA 56.1 GAG CGC TTT AGC ATT GGC AT 56.4 241

PCR 1. Denaturation 2. Annealing –Taq Polymerase 3. Elongation

Sample 제작 V. vnl의 RNA 추출 - RNA 다룰 때 유의사항 Reverse transcription Amino Allyl Labeling - DNA : Cy3(녹색), RNA : Cy5(붉은색) Multiplex-PCR

Central dogma

Hybridization

실험 결과

결과 분석 & 토의 발현 양상 Positive control과 비교 2nd line 에서 RNA 발현 Trouble shooting Edge drying Comet High background

결론 DNA hybridization을 통해 어떤 균이 실제로 있는지 알 수 있고 RNA (cDNA) hybridization을 통해 어떤 gene이 turn on 되었는지도 알 수 있다. Spot의 밝기를 정량적으로 분석한다면 발현의 정도 역시 정량적으로 분석가능하나 이번 실험에서는 다른 spot들과의 비교를 통해 발현의 정도를 알아보았다.

Reference Molecular Biology of The Gene, Watson 외 5명, 4tyh, Benjamin cummings, pp97~111 The cell, Geoffery M.Cooper 외 1명, 3rd, ASM press, p4, 8 pp29~31, 95~96, 115~116 생명과학, 김명원 외 4명, 4th, 라이사이언스, p202,209 pp161~171 Molecular cloning mannual –DNA Microarray, David Bowtell and Josep sanbrock Baldi, P. and Hatfield G. W. DNA microarray and Gene Expression, Cambridge University Express, 2002