New Insight in Hepatitis Profile Interpretation B형간염의 이해

Hepatitis B Dane Particle HBsAg Polymerase dsDNA HBcAg

HBV Genome Core Gene Core nucleocapsid protein & HBeAg Surface Gene Pre-S1, pre-S2, & S protein X Gene X protein Polymerase Gene A large protein with functions critical for packing & DNA replication

Serological and clinical patterns of acute HBV infections Symptoms HBeAg Anti-HBe Total anti-HBc Titer IgM anti-HBc Anti-HBs HBsAg Wk after exposure

Hepatitis B surface antigen (HBsAg) HBV Hepatitis B surface antigen (HBsAg) HBV 급성 감염시 가장 처음 나타나는 표지자 감염 후 6개월 이상 지속적으로 HBsAg이 발견되면 만성감염을 의심 HBV 감염의 진단 및 수혈 혈액의 선별검사로서 유용한 검사 HBsAg에 대한 특이적인 항체는 anti-HBs

Anti-HBs Anti-HBs는 HBsAg에 대한 특이항체 감염 증상 발현 후 1∼4 개월에 생성 HBV Anti-HBs는 HBsAg에 대한 특이항체 감염 증상 발현 후 1∼4 개월에 생성 Anti-HBs가 생성되면 일단 임상적으로 HBV 감염에서 회복을 의미 향후 HBV 감염에 대한 면역 획득 Anti-HBs는 HBV를 중화시켜 HBV 감염을 예방할 수 있는 항체

Hepatitis B core antigen (HBcAg) HBV HBcAg은 바이러스 DNA를 둘러 싸고 있는 단백에서 유래된 항원 혈중으로 분비되지 않으므로 혈청검사에서 검출불가 가장 정확한 바이러스 증식을 나타내는 표지자 HBcAg은 간세포 표면에 발현되어 감염된 세포를 사멸시키는 면역작용을 유발 HBcAg에 대한 특이적인 항체가 anti-HBc

Anti-HBc Anti-HBc는 HBcAg에 대한 특이항체이지만 바이러스를 중화시키지는 못함 HBV Anti-HBc는 HBcAg에 대한 특이항체이지만 바이러스를 중화시키지는 못함 IgM과 IgG의 두 종류가 존재 IgM anti-HBc는 감염 초기에 나타나는 항체로서 특히 anti-HBs가 음성인 상태에서 IgM anti-HBc가 양성이면 급성 HBV 감염을 의미 IgG anti-HBc는 만성 HBV 감염에서도 양성이지만 HBV 감염 후 회복된 환자에서도 양성 Anti-HBc는 전에 HBV의 감염이 있었음을 의미하는 표지자 

Hepatitis B e antigen (HBeAg) HBV HBeAg은 HBV 감염 후 3∼6주에 나타나는 항원으로 가장 감염력이 높은 급성 감염기에 나타나는 표지자 HBeAg이 감염 후 10주 후까지도 지속되면 만성 감염으로 진행함을 의미 HBeAg이 지속적으로 나타나면 만성 활동성 간질환을 의심 일반적으로 HBeAg이 지속적으로 존재하면 감염력이 있고 바이러스의 증식이 지속됨을 의미 Pre-core/core 유전자에 변이가 발생하면 HBeAg이 소실되지만 바이러스의 증식은 그대로 지속되므로 주의 요망

Anti-HBe HBV Anti-HBe는 HBeAg에 대한 특이항체 급성 감염 후 회복되는 시기에 HBeAg이 사라지고 anti-HBe가 출현하면(seroconversion) HBV 감염에서 회복되는 좋은 예후를 보이는 소견 일반적으로 anti-HBs가 생성되지 않고 HBsAg이 지속되는 경우에도 HBeAg이 양성인 경우보다는 anti-HBe가 양성이면 바이러스의 증식이 감소하고 감염력이 감소하는 것으로 생각 일부에서는 anti-HBe가 출현하더라도 HBsAg이 지속되고 anti-HBs가 생성되지 않는다면 pre-core/core 유전자에 변이가 발생하여 HBeAg이 소실되고 anti-HBe가 생성된 경우로서 이 경우 anti-HBe가 양성이더라도 바이러스의 증식은 그대로 지속되므로 주의 요망 

HBV DNA HBV DNA는 감염 후 1주일이면 PCR이나 hypbridization assay로 검출 가능 최근에는 S 유전자에 변이가 발생한 경우 생성되는 HBsAg의 'a’ 결정기가 기존의 항체와 반응하지 않을 수 있으므로 HBsAg이 양성임에도 불구하고 기존의 검사키트로 검출이 안 되는 경우가 있을 수 있는데, 이러한 경우 HBV DNA를 검출하여 HBV 감염 진단 가능

+ - - - +/- - + - + + + - - - + - - - - - - + - - + - +/- +++ - + + - HBV 감염시기 별 나타나는 표지자 종류 감염시기 HBsAg Anti-HBs IgM Anti-HBc IgG Anti-HBc HBeAg Anti-HBe 잠복기 말기 + - - - +/- - 급성감염 보균자 + - + + + - HBsAg (-) 급성감염 - - + - - - Anti-HBs 생성없이 회복 - - - + - - 건강보균자 + - +/- +++ - + 만성간염보균자 + - +/- +++ + - 최근 감염 후 회복 - ++ +/- ++ - + 과거 감염 후 회복 - +/- - +/- - - HBV 백신접종 - ++ - - - -

HBsAg은 양성인데 anti-HBc가 음성인 경우 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 HBsAg은 양성인데 anti-HBc가 음성인 경우 HBsAg이 양성인 경우 anti-HBc는 거의 항상 양성 HBsAg이 양성인 이 때 anti-HBc가 음성이라면  임상증상이나 간기능에 변화를 가져오기 이전의 급성 감염 잠복기 초기를 의심

HBsAg은 양성인데 anti-HBc가 음성인 경우 HBsAg carrier infants During the course of chronic hepatitis B virus infection Blood donors positive for HBsAg and negative for anti-HBc antibody

HBsAg carrier infants R NR NR NR NR P HBeAg Anti-HBc Anti-HBs Anti-HBe HBV DNA R NR NR NR NR P Occurred almost exclusively in children who were infected perinatally Immune incompetence to the HBV antigens Persist for more than 10 years Hepatitis B immunization did not have significant effect on the clinical course in carriers.

During the course of chronic HBV infection HBsAg HBeAg Anti-HBc Anti-HBs Anti-HBe HBV DNA R R NR NR NR P Healthy HBsAg carriers shedding of serologically undetectable quantities of complete and/or defective HBcAg from liver cell nuclei which contain HBcAg not detectable by immunofluorescence maintain the production of anti-HBc

Blood donors positive for HBsAg and negative for anti-HBc antibody HBeAg Anti-HBc Anti-HBs Anti-HBe HBV DNA R R/NR NR NR NR P Infectious at the time of their blood donation Anti-HBc antibody screening must not replace HBsAg screening for blood donations.

HBsAg, anti-HBc 및 anti-HBs가 모두 양성 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 HBsAg, anti-HBc 및 anti-HBs가 모두 양성 HBsAg이 양성인 경우 anti-HBc는 거의 항상 양성 Anti-HBs가 양성이면 HBsAg이 소실되어야 하므로, HBsAg과 anti-HBs가 모두 양성인 경우는 비정상적인 검사결과

HBsAg과 anti-HBs가 동시에 양성인 경우 서로 다른 아형에 의한 중복감염 면역체계 이상으로 HBsAg 'a'결정기와 결합할 수 있는 anti-HBs를 만들지 못하는 경우로서 anti-HBs와 유사한 클론의 항체반응이 일어나 면역학적 검사방법에서 HBsAg과 교차반응을 일으키는 비특이적인 항체 존재 HBV에 변이가 발생한 경우

Anti-HBc만 양성인 경우 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 HBV 감염 후 완전히 회복되면 HBsAg이 사라지고 anti-HBs가 생성되어야 하지만 불완전하게 회복된 경우 anti-HBs가 음성이면서 anti-HBc만 양성 HBV 감염 후 오랜 시간이 지나면 anti-HBs 역가가 점점 떨어져서 음성이고 anti-HBc만 양성 HBsAg 유전자에 변이가 발생하면 변이된 유전자가 생성하는 HBsAg이 기존의 항체와는 반응하지 않을 수 있으므로 면역검사법으로 측정하였을 떄 HBsAg이 음성이고 anti-HBc만 양성--- 이 때 임상적으로 HBV 감염이 강력히 의심되면 HBeAg이나 HBV DNA를 검출하여야 진단

HBsAg이 음성인데 HBeAg이 양성인 경우 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 HBsAg이 음성인데 HBeAg이 양성인 경우 HBsAg이 음성인데 HBeAg이 양성인 경우는 급성 HBV 감염 초기에 일시적으로 나타날 수 있는 소견이기는 하지만 매우 비정상적인 결과이므로 검사 결과를 확인하여야 한다. Mutant HBV가 감염된 경우

HBeAg과 anti-HBe가 동시에 양성인 경우 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 HBeAg과 anti-HBe가 동시에 양성인 경우 HBeAg이 소실되고 anti-HBe가 생성되는 혈청전환(seroconversion) 시기에 일시적으로 나타날 수 있는 매우 드문 소견 HBeAg이 사라지고 anti-HBe가 출현하기 까지 잠시 두 표지자가 모두 양성으로 나오는 시기가 있을 수 있는데, 이 경우 기다리면 HBeAg이 소실되고 anti-HBe가 계속 출현할 것이므로 환자에게는 좋은 예후를 보이는 소견

HBsAg이 양성인데 HBeAg과 anti-HBe가 모두 음성인 경우 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 HBsAg이 양성인데 HBeAg과 anti-HBe가 모두 음성인 경우 HBV의 정상적인 감염 과정에서 ‘e window'에 해당되는 시기 (HBeAg이 사라지고 anti-HBe가 출현하기 까지 잠시 두 marker가 모두 음성으로 나오는 시기) --- 이미 HBeAg은 소실되었고 기다리면 anti-HBe가 출현할 것이므로 환자에게는 좋은 예후를 보이는 소견 다른 가능성은 HBV의 precore/core region에 변이(precore stop mutation)가 발생하여 HBeAg은 만들지 못하지만 anti-HBe가 형성되지는 않은 경우

백신을 접종받지 않는 사람에서 anti-HBs만 양성인 경우 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석 백신을 접종받지 않는 사람에서 anti-HBs만 양성인 경우 passiver transfer 백신접종에 의하여 형성된 항체는 수 년간 양성 passiver transfer에 의한 항체는 3∼6개월 양성

Case (37/M, Alcoholic hepatitis) Date HBsAg Anti-HBs Anti-HBc Sep 2003 Non- Reactive Non- Reactive Non- Reactive Nov 2003 Non- Reactive Reactive 49.9 mIU/mL Non- Reactive Sep 14 ~ Sep 24 : FFP 32 unit transfused

HBV 변이의 종류 S 유전자 변이 P 유전자 변이 Precore/core 유전자 변이 항바이러스 치료에 내성을 유발 HBsAg ‘a’ 결정기에 변이 기존의 항체(anti-HBs)와 반응 안 할 수 있슴 Precore/core 유전자 변이 HBeAg 분비 중단 / 감소 바이러스 증식에도 불구하고 HBeAg (-) P 유전자 변이 항바이러스 치료에 내성을 유발

S 유전자 변이 자연적으로 발생 고농도의 anti-HBs에 장기간 노출된 경우 HBsAg 양성 산모에서 태어난 신생아에서 HBIG 및 HBV 백신을 접종한 경우 B형간염과 관련된 질환으로 인하여 간이식술을 시행 받은 후 예방 목적으로 고농도의 HBIG을 투여 받는 환자

S Gene Mutant & HBV Subtype 122 / 160 122 adr Lys / Arg 160 adw Lys / Lys ayr Arg / Arg ayw Arg / Lys Lys (AAA) Arg (AGA) AA structures Different for Subtypes

Vaccine Escape Mutant HBsAg 양성 산모에서 태어난 신생아에서 HBIG 및 HBV 백신을 접종한 경우 산모의 혈액에 이미 소량의 mutant HBV가 존재하고 있었는데 백신 접종으로 형성된 항체가 wild type의 HBV를 억제하므로 wild type HBV는 사라지고 항체가 억제시킬 수 없는 mutant HBV가 증식 백신 접종으로 형성된 항체가 wild type HBV를 자극하여 mutation 초래

Immunosuppression HBIG-driven immune selection Prevalence 8.3% ~ 62.5% Immunoprophylaxis in Liver Transplant Recipients B형간염과 관련된 질환으로 인하여 간이식술을 시행 받은 후 예방 목적으로 고농도의 HBIG을 투여 받는 환자 Immunosuppression HBIG-driven immune selection Prevalence 8.3% ~ 62.5%

진단검사 키트로 검출 안 될 가능성 Anti-HBs가 양성이어도 mutant HBV 방어 불가 변이된 S유전자에 의하여 생성되는 HBsAg은 기존의 특이항체인 anti-HBs로 중화되지 않는다. 진단검사 키트로 검출 안 될 가능성 Anti-HBs가 양성이어도 mutant HBV 방어 불가

HBsAg Epitope & Mutation HBV HBsAg Epitope & Mutation determinant “a” Lys to Glu 141 145 Gly to Lys, Arg Thr, Ile to Asn 126 C - S S - C C - S S - C C 139 137 147 123 124 122 Thr Asn insertion The most common HBsAg mutants cluster near aa 141-145. The most prevalent of these mutants reported is gly-145-arg.

Why are HBsAg Mutants important? Diagnosis Why are HBsAg Mutants important? 검사키트에 따라 검출 불가 False Negative Results Mutant HBV 에 감염된 경우 HBsAg이 음성이므로 진단이 지연되거나 어려움 이 경우 HBV 감염이 의심되면 HBeAg이나 HBV DNA를 검출하여야 진단 가능

Detection of Recombinant HBsAg Mutants Abbott Asxym Other Wild type ✚✚ ✚✚ Thr/Ser 126, Gln/His 129 ✚✚ ✚✚ Met/Leu 133 ✚✚ ✚ Asp/Ala 144 ✚✚ ▬ Gly/Arg 145 ✚✚ ✚✚ Thr/Ser126 + Gly/Arg145 Pro/Leu142 + Gly/Arg145 Pro/Ser142 + Gly/Arg145 Asp/Ala144 + Gly/Arg145 ✚✚ ▬ Negative Control ▬ ▬

Why are HBsAg Mutants important? Prevention Why are HBsAg Mutants important? Vaccination Failure 백신 접종을 실시하였지만 mutant HBV가 검출될 수 있다. HBV 만연지역에서는 HBsAg 양성 산모에서 태어나 HBIG 및 HBV 백신을 접종한 신생아의 2-3%에서 vaccine escape mutant가 발견된다.

Why are HBsAg Mutants important? Clinical Why are HBsAg Mutants important? Fulminant Hepatitis Gly 145 arg was one of the mutations involved in this case of Fulminant Hepatitis. (Kalinina et al., Hepatology 34: 385, 2001)

혈청학적 검출의 문제점 HBsAg mutation 검출이 고려되지 않은 검사 키트로는 false negative result 가능 따라서 HBsAg mutation이 존재할 경우 검사 키트에 따라 HBsAg 검사결과에 차이가 존재 미국 FDA에서는 제조회사에 mutant detection에 관한 data를 요구하기 시작하였고, 제조회사의 package insert에 mutant를 검출하지 못할 수 있다는 경고문을 제공하도록 권고

Precore/core 유전자 변이의 문제점 바이러스 증식에도 불구하고 HBeAg (-) HBeAg이 음성이어도 HBV 증식은 지속되고 HBV DNA 양성 Precore나 core 변이가 multiple하게 발생하면 바이러스의 독성이 증가하여 임상적으로 fulminant hepatitis 초래

Prevalence of Precore Stop Mutation US Europe Fulminant hepatitis (10%) Chronic active hepatitis (12-27%) Asia, Africa Southern Europe Middle East Chronic active hepatitis (47-60%) Korea Chronic active hepatitis (90%)

Where have Precore Mutants been found Healthy Chronic HBV Carriers Patients with Fulminant Hepatitis Patients with Aggressive Chronic Hepatitis B

P 유전자 변이의 문제점 항바이러스 치료에 내성을 유발 Lamivudine 과 같은 핵산유사체 항바이러스 치료제는 역전사효소를 저해함으로써 바이러스 복제 억제 약제 내성 돌연변이 1년: 10~15% 2년: 20~30% 3년: 40~55%

Clinical Importance of YMDD Genotyping 항바이러스 치료의 최적 지침 수립 및 효과적 모니터링 내성의 조기 진단 및 예측 DNA 음전상태에서 variant predominance 여부 확인 Viral breakthrough시 내성의 확진 대체 약제 처방의 근거  Adefovir, Interferon

Clinical Impact of HBV Genome Variability HBV genotypes Severity of liver disease Response to antiviral therapy HBV mutants Pre-core mutants Natural history of the disease Polymerase mutants Drug resistance S gene mutants Vaccine or HBIG escape mutants Occult infection

HBV Genotype (A s G) Distinct geographical distributions A - North west Europe and North America B - SE Asia C - Far East D - Mediterranean basin, India, Middle East Spontaneous HBeAg seroconversion B earlier than C Activity of liver disease and risk of progression to cirrhorisis (C>B) Response to IFN A better than D B better than C

Occult HBV Infection Detection of HBV DNA without HBsAg with or without the presence of HBV antibodies outside the acute phase window period

Silent HBV Infection Presence of HBV DNA in serum or liver tissue in the absence of hepatitis B surface antigen (HBsAg), anti-HBc and anti-HBs in serum Caused in part by HBV mutants that produce a very low level of HBsAg, which escape detection by currently available serologic tests

Risk of transfusion-transmitted viral infection Incidence and estimated rates of residual risk for HIV, HCV, HBV and HTLV in blood donors in Canada, 1990-2000. (Chiavetta et al. CMAJ 2003) The risk of transfusion-transmitted infection (or "residual risk") per million donations HIV 0.10 (1 in 10,000,000 donations) HCV 0.35 (1 in 2,860,000 donations) HBV 13.88 (1 in 72,000 donations) HTLV 0.85 (1 in 1,180,000 donations)

Risk of transfusion-transmitted viral infection Estimation of the risk of HBV, HCV and HIV infectious donations entering the blood supply in England, 1993-2001. (Soldan et al. Vox Sang 2003) The risk of transfusion-transmitted infection HBV 1 in 260,000 donations HIV 1 in 8 million donations HCV 1 in 520,000 during 1993-98 1 in 30 million during 1999-2001

False-Negative Results In HBV Commercial Assays HBsAg below the detection limit Virus variants not recognized by the antibodies employed in the assays

Hepatitis B Virus Production: 1011-1013/day HBV Production: 1011-1013/day High levels in blood (102 to 1010 copies/ml) HBeAg (+) Chronic Hepatitis B : 107~ to 1011 HBeAg (-) Chronic Hepatitis B : 104~ to 108 Inactive HBsAg Carrier State : < 101~ to 104 Mutation rate: 1-3 x 10-5/site/yr

HBsAg Below the Detection Limit HBV Window Period between Virus Exposure and the First Appearance of Detectable Antigen or Antibody HBV Carriers Who Lack Detectable HBsAg

Window Period HBV Transmissions Retrovirus Epidemiology Donor Study (REDS, 1996) : 1 in 63,000 donations using the incidence window-period model Transmission of HBV from HBsAg(-), anti-HBc(+) donors : 1 in 52,000 donations (Allain et al. 1999), 1 in 49,000 donations (Kleinman et al. 2003)

Risk of transfusion-transmitted HBV infection Analysis of Reported Post-Tx Cases in Japan (Matsumoto et al. Transfusion 2001) 141 “TA-HBV” cases reported 97-99 103 Fully investigated All HBV DNA(-) donations linked to 1 case No viral markers in any donated blood in 88 cases 15 HBV DNA(+) donations linked to 14 cases

141 “TA-HBV” cases reported 97-99 Analysis of Reported Post-Tx Cases in Japan (Matsumoto et al. Transfusion 2001) 141 “TA-HBV” cases reported 97-99 103 Fully investigated 10 donors in pre-HBsAg-positive window period Retested HBsAg with a more sensitive assay 4 Donors - HBV DNA (+) 3000, 3300, 800, 500 copies/mL 5 donors HBsAg (+) 5 donors HBsAg (-) 1 Donor - HBV DNA (-) < 50 copies/mL

All HBV DNA(-) donations linked to 1 case Analysis of Reported Post-Tx Cases in Japan (Matsumoto et al. Transfusion 2001) 141 “TA-HBV” cases reported 97-99 103 Fully investigated All HBV DNA(-) donations linked to 1 case 43 donors All HBV DNA (-) Donated Blood Same Mutation in Pre-S2 Start Codon 1 donor (Window period) HBsAg (+) detected 6 weeks after donation

Low-Level Viremia HBV carriers who lack detectable HBsAg Occult hepatitis B virus infection HBsAg(-), anti-HBc(+), HBV DNA(+) Risk of transfusion-transmitted HBV infection

HBsAg(-), anti-HBc(+) HBV HBV DNA is highly unlikely to be present in units with anti-HBs levels greater than 100 mIU/mL. Transfusion to anti-HBc-positive blood with high levels of anti-HBs (titer >1:16, ≈ 200 mIU/mL) is permitted in Japan and no posttransfusion cases have been documented from such units.

HBV DNA Detection in HBsAg(-), anti-HBc(+) patients in Chung-Ang University Hospital (2004) HBV DNA tested in 17 patients with HBsAg(-) and anti-HBc(+), using Cobas Amplicor HBV Monitor TestTM (Roche, Branchburg, NJ, USA) HBV DNA HBV DNA (copies /mL) Neg < 300 300~2,000 2,000~10,000 >10,000 Pt. No. 3 2 5 5 2 Copies/mL - 157 172 417, 649, 659 1480, 1650 2010, 3190 3990, 6920, 9770 10600 14600

Transfusion-transmitted HBV infection을 예방하려면 (1) More Sensitive Assays for HBsAg Needed Sensitivity Ranges (HBsAg/mL) 0.10 ~ 0.20 ng in Newer Tests for HBsAg 0.4 ~ 1.0 ng in Some of the Older Tests for HBsAg

FDA RECOMMENDATIONS FDA recommends that HBsAg detection assays that are used to test blood, blood components, and Source Plasma donations have a lower limit of detection capability of 0.50 ng HBsAg/mL or less.

Sensitivity of HBsAg Assays Abbott Asxym (MEIA) ADVAIA Centaur (CLIA) Seroconversion panel (Subtype ad, ay) 0.10 ~ 0.20 ng/mL

Transfusion-transmitted HBV infection을 예방하려면 (2) Detection of Mutant HBV HBsAg mutation 검출이 고려되지 않은 검사 키트로는 false negative result 가능 따라서 HBsAg mutation이 존재할 경우 검사 키트에 따라 HBsAg 검사결과에 차이가 존재 미국 FDA에서는 제조회사에 mutant detection에 관한 data를 요구하기 시작하였고, 제조회사의 package insert에 mutant를 검출하지 못할 수 있다는 경고문을 제공하도록 권고

Conclusion 비정상적인 HBV 표지자 검사 결과 해석에 주의 Low level viremia도 감염의 위험이 있으므로 특히 수혈시 주의