Multiplex PCR 방법을 이용한 Seeplex® STD6 ACE Detection의 소개와 평가 2008. 6. 12 한 금희

목 적 일부 성병의 원인 균은 배양이 잘 되지 않는 특성을 지니고 있어 임상에서 성병의 진단에 어려움이 있다. 본 연구의 목적은 분자진단방법(PCR)을 이용하여 여러 가지 다양한 성병의 원인 균을 감별함으로써 이러한 문제점을 보완하고 진단에 도움이 되고자 실시하였다.

분자진단 검사법의 중요성 [참고문헌] JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2004, p. 3089–3093 Comparison of the APTIMA CT and GC Assays with the APTIMA Combo 2 Assay, the Abbott LCx Assay, and Direct Fluorescent-Antibody and Culture Assays for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae 『Culture is inherently limited because it relies on viable organisms for detection. Culture and DFA are subject to interpretation by the microscopist, whereas nucleic acid amplification assays may offer more accurate and objective results. 배양법은 보이는 것에 의존하여 원인균을 검사하므로 본질적으로 제한이 있다. 배양법과 DFA는 전문가에 의해 주관적으로 해석이 되는 반면에 유전자 증폭 방법(PCR)은 보다 정확하고 객관적인 결과를 제공한다. 』 『 분자진단 검사법은 기존의 배양법이나 DFA와는 달리 핵산을 이용하여 유전자를 증폭하는 방법이기 때문에, 결과가 보다 더 정확하고 객관적이라고 할 수 있습니다.우리가 흔히 이야기하는 PCR(Polymerase Chain Reaction)방법이 곧 분자진단 검사방법이라고 할 수 있습니다.

(Instrument or Manual kit) PCR을 이용한 검사과정 핵산 (DNA) 추출 (Instrument or Manual kit) PCR 결과물 검사 (agarose gel or automated instrument) 분자진단 검사 (PCR machine) Qiagen Qiaqube agarose gel 이용 분자진단 검사 (PCR) Manual kit Capillary 전기영동 (lab901 장비 이용)

Lab 901 Screentape 장비 사용결과 (Cat No. SD6600Y) [Lab 901 자동화 장비 사용 예] Internal control (IC) Trichomonas vaginalis (TV) Mycoplasma hominis (MH) Mycoplasma genitalium (MG) Chlamydia trachomatis (CT) Neisseria gonorrhoeae (NG) Ureaplasma urealyticum (UU) negative Positive Top Marker Internal control (IC) Trichomonas vaginalis (TV) Mycoplasma hominis (MH) Mycoplasma genitalium (MG) Chlamydia trachomatis (CT) Neisseria gonorrhoeae (NG) Ureaplasma urealyticum (UU) Bottom Marker

SeePlex STD 6 ACE DETECTION 성병의 원인 6균종을 한 번에 검사할 수 있는 Multiplex 방법이다. -  6가지 병원균은 다음과 같다     1) Trichomonas vaginalis  (TV)      2) Mycoplasma hominis    (MH)      3) Mycoplasma genitalium  (MG)    4) Chlamydia trachomatis  (CT)      5) Neisseria gonorrhoeae  (NG)    6) Ureaplasma urealyticum (UU)

6가지 균종이 잘 나타나는 검체와 질환 1 • 뇨 시료 (Urine) • 성기 궤양 (genital ulcer) • - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis • 성기 궤양 (genital ulcer) - Trichomonas vaginalis - Herpes simplex virus 1 - Herpes simplex virus 2 - Treponema pallidum - Heamophilus ducreyi - Lymphogranuloma Venereum (LGV) • 요도염/자궁경구염/질염 (Urethritis / Cervicitis / Vaginitis) - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis - Trichomonas vaginalis - Gardnerella vaginalis - Mobiluncus mulieris - Mobiluncus curtisii - Bacteroides fragilis - Candida albicans - Candida glabrata - Candida parapsilosis - Herpes simplex virus 1 - Herpes simplex virus 2 - HPV (14 High Risk) - HPV (5 Low Risk)

6가지 균종이 잘 나타나는 질환 2 • • 골반내감염/불임 (PID / Infertility) • - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis - Trichomonas vaginalis • 에이즈+남성 스크리닝 (HIV + Males Screening) - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis • 에이즈 HIV + Females Screening - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis - Trichomonas vaginalis - Gardnerella vaginalis - Mobiluncus mulieris - Mobiluncus curtisii - Bacteroides fragilis - Candida albicans - Candida glabrata - Candida parapsilosis - HPV (14 High Risk) - HPV (5 Low Risk)

6가지 균종이 잘 나타나는 질환 3 • 무증상의 임신하지 않은 여성들을 위한 스크리닝 • 무증상의 임신여성을 위한 스크리닝 - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis - Trichomonas vaginalis - Gardnerella vaginalis - Mobiluncus mulieris - Mobiluncus curtisii - Bacteroides fragilis - Candida albicans - Candida glabrata - Candida parapsilosis - Herpes simplex virus 1 - Herpes simplex virus 2 - HPV (14 High Risk) - HPV (5 Low Risk) 무증상의 사람들을 검사해야 하는 필요성 “Because the majority of individuals with C. trachomatis and N. gonorrhoeae infections are asymptomatic, routine laboratory screening of sexually active, asymptomatic individuals at high risk for infection has been recommended by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 대부분의 C. trachomatis 와 N. gonorrhoeae 감염의 경우, 무증상이므로 미국 CDC는 성경험이 활발한, 위험요소를 가진 사람들을 정기적으로 스크리닝 하는것을 권장합니다. ” [참고문헌] Workowski, K. A., and W. C. Levine. 2002. Sexually transmitted diseases treatment guidelines —2002. Morbid. Mortal. Wkly. Rep. 51:1–80. • 무증상의 임신여성을 위한 스크리닝 - Chlamydia trachomatis - Neisseria gonorrhoeae - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Mycoplasma hominis - Trichomonas vaginalis - Gardnerella vaginalis - Mobiluncus mulieris - Mobiluncus curtisii - Bacteroides fragilis - Candida albicans - Candida glabrata - Candida parapsilosis - Herpes simplex virus 1 - Herpes simplex virus 2 - Group B Strep - CMV - HPV (14 High Risk) - HPV (5 Low Risk)

검사 방법 기간: 2008년 4월~ 5월 대상: 본원에 의뢰된 검체 (U.U와 M.H) 건수: 71검체 검사방법: 검체는 미생물검사실로 의뢰된 배양액중에서 200 ul를 채취하여 사용함 핵산 추출은 QIAGEN사의 QIACUBE를 이용 정성검사는 Multiplex PCR법 이용 결과확인은 Agarose gel을 이용한 전기영동

결과 분석 예1 M 4 5 6 7 8 11 13 16 N M Sample Result Mycoplasma IST2 PCR 4 - 5 UU CT, UU 6 TV 7 8 UU, MH 11 MH 13 MH, UU 16

결과 분석 예2 Sequencing Sample 5_CT AGGAGGACTGAATAGGAAATTCACAGTCACACCCAAAAGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAGATATTATTGCATCAAGAATGGAAGGCGGCGTTGTTCTAGCTTTGGTACGAGAAGGTGATTCTAAGCCCTGCGCGATTAGTTATGGATACTCATCAGGCGTTCCTAATTTATGTAGTCTAAGAACCAGCATTACTAATACAGGATTGACTCCAACAACGTATTCATTAC Blast 결과 gi|76168153|gb|CP000052.1| Chlamydia trachomatis A/HAR-13 plasmi... 464 e-128 gi|144607|gb|M19487.1|PLMORF Chlamydia trachomatis plasmid pCTT1... 456 e-126 Sample 6_TV GGTCAGTACGCATTGAACACGGTATCGTCAACAACTGGGATGATATGGAAAAGATCTGGCACCACACATTCTACAACGAACTTCGTGTTGACCCAACAGAGCACCCAGTTCTTCTTACAGAAGCCCCACTCAACCCAAAGGCTAACCGTGAGAAAATGATCTCCCTCATGTTCGACACATTCAACGTCCCATCCTTCTATGTCGGCATCCAGGCTGTTCTTTCCCTCTACTCCTCTGGCCGTACAACAGGTATCGTTTTCGATGCTGGTGATGGTGTTTCCCACACAGTTCCAATTTACGAAGGCTACTCCCTTCCACACGCCATCATGAGACTTAACCTCGCTGGCCGTGATCTCACAGCCTGGATGGTCAAGCTTCTCACAGAGCGTGGCAA gi|123189105|ref|XM_001281985.1| Trichomonas vaginalis G3 actin ... 1138 0.0 gi|154417955|ref|XM_001581947.1| Trichomonas vaginalis G3 actin ... 1138 0.0

결과 분석 1 Pathogens Results (N=71) Mycoplasma IST 2 Multiplex PCR T. vaginalis 1(2%) M. hominis 7(10%) 4(6%) U. urealyticum 25(36%) 6(9%) C. trachomatis M. genitalium N. gonorrhoeae Multi-det. 7 (MH & UU) 2 (CT&UU / MH&UU) Negative 39 58 Total 71 48검체중 4개의 검체는 동일한 결과 배양에서 검출하지 못한 균(M.genitalium) 을 PCR방법에서는 양성의 결과를 얻음 배양에서는 16검체에서 UU가 양성으로 동정되었으나 PCR 방법으로는 4검체에서만 UU가 양성으로 나왔다 배양에서 UU와 MH 양성인 검체가 PCR 방법에서는 음성으로 나왔다

결과 분석 2 PCR 검체건수 Mycoplasma IST 2 UU.MH 1 UU MH 2 ㅡ 3 UU. UU.CT TV 12 MG

결과 분석 3 양성 26검체 중 4개의 검체는 결과가 동일하게 나왔다 양성 26검체 중 4개의 검체는 결과가 동일하게 나왔다 Mycoplasma IST 2에서 검출할 수 없는 균(C.tracomatis & T.vaginalis. M.genitalium) 들을 PCR방법으로는 검출할 수 있었다. Mycoplasma IST 2에서는 25 검체에서 U.U가 양성으로 나왔으나, PCR 방법으로는 6 검체에서 양성으로 나왔다 Mycoplasma IST 2에서는 7 검체에서 M.H가 양성으로 나왔으나, PCR 방법에서는 4 검체에서 양성으로 나왔다 Mycoplasma IST 2에서는 7검체에서 중복감염(M.H & U.U)이 확인되었으나, PCR 방법에서는 2검체 (M.H & U.U 과 C.T & U.U)에서 중복감염이 확인되었다

고찰 1 Mycoplasma IST 2 에서 U.U 로 보고된 25검체 중 PCR방법에서 음성으로 나온 19검체는 U.parvum 일 것으로 추정된다 ** 관련근거 : journal of clinical microbiology, Mar. 2000, p. 1175 – 1179 Species Identification and Subtyping of Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum Using PCR-Based Assays. Mycoplasma IST 2 에서 양성(M.H)으로 나온 검체가 PCR방법에서 음성으로 나온 이유는 DNA 가 낮은 copy수로 존재하여 Seeplex STD의 Detection cut-off limit이하로 생각된다.

고찰 2 Ureaplasma 는 U.urealyticum 과 U. parvum이 있는데 ,기존의 검사방법은 2가지를 구분할 수 없는 방법이다. 이들을 구분할 수 있는 방법으로는 PCR 방법이 가장 유용하다고 알려져 있다 본 PCR방법은 U. urealyticum 만을 검사하도록 설계되어 있어서 U.parvum 은 detection 할 수 없다.

향 후 진 행 Mycoplasma IST 2 검사법에서U.Urealyticum으로 보고된 균들 중 PCR방법에서 음성으로 나온 검체들은 U.parvum일 가능성이 크다. 현재 U.parvum 에 해당하는 primer 디자인 및 제공을 요청한 상태다.( 씨젠에서는 primer 디자인을 진행 중에 있으며, primer 합성은 미국 ITD사에 의뢰할 예정이다) Primer 합성이 완료되면, U.parvum 양성균주를 이용한 primer test를 계속 진행할 예정이다 (19검체에 대한 검사를 실시하여 만족할 만한 결과를 얻어볼 수 있을 것으로 기대한다)

국내, 해외 사용처 국내 해외 In Use : 검진센터 이원, 녹십자, SCL 종합병원 건국대병원, 전남대병원, 강남성모병원, 마산삼성병원, 단국대천안병원, 성모자애병원, 강북삼성병원, 전남대병원, 중앙대병원, 부천성가병원, 충남대병원, 명지대병원, 여의도 성모병원, 중대용산병원, 일산명지병원 Under Evaluation : 순천향대부천병원, 고신대병원, 한양대병원, 삼성의료원, 보험공단 일산병원, 강동성심병원, 성빈센트병원, 한양대구리병원 해외 Leisure (일본), Medca Japan (일본), Bio-Reference Lab (미국), 이스라엘, 베네수엘라, 멕시코, 브라질, 이탈리아, etc TDL 검진센터 (영국), 미국, 유럽 다수국가, 아시아 다수 국가,

보험 수가 청구 방법 해당 제품: Seeplex® STD 전 제품 검사방법 : 중합효소 연쇄반응법(기타) C5956006 적용(각각 청구) 검사수가 : 24,290원/1종 청구방법 : 일반적으로 3종 청구를 시행함. 3종 청구 시 보험수가: 24,290 X 3 = 72,870원 관련근거: 고시 2007-139호 2008.1.1 시행

감사합니다.

민감도 검사 10 copies Lane 1 2 3 4 5 6 7 8 Copy No. 106 105 104 103 102 101 NA FIG. 2. multiplex PCR의 민감도 검사. 박테리아 유전자가 클로닝 된 plasmid 샘플 (106~1 copy)을 이용하여 single 과 multiplex PCR를 수행하였으며, single과 multiplex PCR 구분 없이 모두 10 copy/reaction 까지 정확하게 검사할 수 있다는 것이 확인되었다.

특이도 검사 FIG. 1. multiplex PCR의 특이도 검사 . Multiplex PCR 증폭 실험을 수행한 결과 타겟 박테리아 (Lanes 1-6) 샘플의 경우 정확하게 각각의 병원체를 검사하였고, 그 외 타겟이 아닌 박테리아 샘플 (lanes 7~18)이나 사람의 유전자 샘플을 사용한 경우 오류 없이 음성으로 나와서, 제품의 특이도가 높다는 것을 확인할 수 있었다. (박테리아 정보: 오른쪽 표 참조, Internal control: 800bp에 모두 양성으로 확인, L: 100bp ladder, SM: Size marker)