Biotechnology and Recombinant DNA Chapter 09 Biotechnology and Recombinant DNA 김하원 교수 1 1

A Glimpse of History 유전자분석 기술로 친자확인 “Dirty War” in Argentina (1976–1983) Military junta(군사정권) killed thousands of citizens Collapsed in 1983 Democratically elected government unsealed records Confirmed ~200 children survived killings, had been kidnapped and placed with pro-junta families Mary-Claire King (then at UC Berkeley) analyzed DNA sequences to reunite children with relatives But parents usually dead or missing Chromosomal DNA difficult to use Used mitochondrial DNA (mtDNA), which is inherited only from the mother

Biotechnology (생명공학) 넌 생명과학과 다니니? 생명공학: 미생물학기술과 생화학기술을 이용하여 문제점 해결과 제품생산 가능해짐. DNA 재조합기술(Recombinant DNA techniques) 생명체의 유전자 변형 가능해짐. 세포에서 유전자 분리하여 다른 세포에 이식 가능해짐. 유전공학(Genetic engineering) 다양한 응용: agriculture, medicine, law enforcement 넌 생명과학과 다니니? 난 생명공학과 다닌다! 두 학과의 차이는 뭐야?

9.1. Fundamental Tools Used in Biotechnology 제한효소 (Restriction enzymes) 염기 4-6쌍을 인식하여 절단함. 인식되는 염기서열은 palindrome. 서열 예: 소주만병만주소 유전자예: Transposon의 양말단 효소처리후 restriction fragment 생성됨 절단후 말단의 종류 Cohesive ends (sticky ends) Blunt ends 재조합 DNA (recombinant DNA) 제조 DNA ligase로 최종연결

9.1. Fundamental Tools Used in Biotechnology 제한효소 명명법: 효소를 분리한 세균의 학명을 사용

Restriction enzymes Bacteria와 archaea가 바이러스의 침입을 막기위해 생산하는 효소임. 종류: 자신의 DNA는 methylase로 methylation시켜서 외래 DNA와 구분함. 제한효소 발견공로로 Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton O. Smith는 1978년에 노벨상 받음. 종류: 제1형 제한효소: 인식부위와 절단부위가 다름. Random하게 절단. 제2형 제한효소: 인식부위와 절단부위가 동일. 주로 dimer임. Homing endonuclease gene (HEG) Selfish genetic element로써 transposon과 유사함. HEG 유전자가 있는 DNA는 잘리지 않지만, HEG가 없는 DNA는 HEG효소로 절단된다. 절단된 DNA에는 HEG 유전자가 복제돼 들어간다. 응용: 숫컷 모기 정자에 HEG를 넣어주면 수정란은 HEG도입되어 박멸됨. Star activity Buffer 조성이 달라질 경우 제한효소 활성이 변하거나 활성이 완전히 소실되는 현상. 즉, 원래 염기서열을 자르지 않고, 비슷한 다른 부위를 자르거나 아예 절단하지 못하는 현상. (Nucl. Acids Res. (2011)) The Homing process

9.1. Fundamental Tools Used in Biotechnology Gel electrophoresis Agarose gel 사용, DNA의 크기에 따라 분리됨 (직류전원 사용). 표품 분자량: DNA ladder (람다 HindIII) DNA는 음전하이므로 양전하(+)로 이동함 암실에서 UV 조사하여 볼 수 있음. RNA, protein도 분리가능함.

9.2. Genetic Engineering의 응용 유전공학 세균으로 다양한 성분 생산 단백질 생산 DNA 생산 연구도구로 응용: DNA cloning IFN: interferon α, β, γ 항바이러스, 항암작용, MHC 발현촉진 EPO: 적혈구 생산촉진 혈액투석하는 빈혈자 항암제 치료받는 빈혈자 정신분열(schizophrenia)환자 뇌 말라리아환자 개선 Glucocerebrosidase 돌연변이되면 Gaucher disease유발됨. 간과 비장에 glucocerebroside 축적되어 비대 PDGF: platelet-derived growth factor 혈관상처시 혈소판 분비물질 혈관신생(angiogenesis), 태아발달 등 Streptokinase Streptococcus가 분비하는 물질 Plasminogen을 plasmin으로 활성화시켜 혈전 용해 용도: 수술후 종창 완해, 혈전성 정맥염

IFN의 작용기전

유전공학 제품 (바이오시밀러 제품) 보조설명 GMO (유전자변형식물): 먹는백신과일 B형 간염 침보다는 혈액, 정액으로 감염 만성시 간경변(Cirrhosis), 간암으로 발전 예방백신주사 Foot and mouth disease: 구제역 (口蹄疫) Chymosin: 응유효소 GMO (유전자변형식물): 살충제, 제초제 저항유전자 삽입 먹는백신과일

Biosimilar란? 의약품의 분류 특허기간중 합성의약품: 화학물질 의약품 바이오의약품: 생물유래 의약품(주로 단백질) 전임상, 임상1상, 임상2상, 임상3상거쳐 약 10년시간과 약 1조원 소요. 특허종료후 Generic 의약품: 특허만료된 복사품 임상시험 없이 약식 허가만으로 승인함 바이오시밀러: 특허만료된 복사품 제조방법에 따라 천차만별로 생산되므로 다른 제품으로 인정함. 임상시험 통해 원래 제품과 동등함을 증명해야 승인함. 임상 2상 생략, 임상3상도 대폭 단축해도 승인. 현재는 해외의 단백질제품(특히 면역제품)의 특허가 종료시점임(1990 -> 2010년). 시장비중: 2012년 현재 17%, 2015년에는 50%로 전망 삼성전자에서 5,000억원 투자발표(2009년) 삼성의료원, 삼성테크윈, 삼성정밀화학, 삼성토탈 등 계열사 연계: 임상시험, 생산 능력

9.2. Applications of Genetic Engineering DNA cloning 세균의 DNA 유전자 분리하여 제한효소 처리 Plasmid도 제한효소 처리 DNA조각과 plasmid의 연결 숙주 세균 주입하여 유전자 증식 대량으로 분리.

9.2. Applications of Genetic Engineering 중요 단백질 생산 high-copy-number vector에 유전자 삽입하여 단백질 대량 생산. 유전공학의 응용 단백질 생산 DNA 생산 연구용: reporter gene

9.2. Applications of Genetic Engineering 단백질 생산: 더 안전, 더 경제적 세균에서 insulin 생산 과거에는 소 또는 양의 췌장에서 분리: 과민반응 유발. 세균에서 재조합단백질은 glycosylation 되지 않아 효능 10-100배 약함 Vaccine 생산 예: B형 간염 백신, 자궁경부암 백신 가축의 구족병(Foot-and-mouth disease, 구제역) 백신생산 치즈생산: chymosin (rennin) 소위장에서 효소 분리 세균으로 고가물질 생산 예: synthetic chromosome in Mycoplasma mycoides

9.2. Applications of Genetic Engineering 2. DNA 생산 특정 DNA segment를 세균에 주입하여 클로닝하여 대량으로 얻음. HGP(human genome project): 사람 유전자: 25,000개 대장균 유전자: 4,500개 범유전체학(metagenomics) 특정환경에 존재하는 세균DNA를 모두 분석 Termed “shotgun cloning” 배양불능인 균이라도 ~99% 유전자분석 가능하게 됨.

9.2. Applications of Genetic Engineering 3. 연구용으로 이용: reporter gene Reporter gene: 발현정도를 알고싶은 유전자 위치에 녹색형광단백질(GFP) 유전자 삽입하여 발현량 측정 종류: GFP, luciferase, lacZ(b-galactosidase) 응용: Transformation and transfection assays Gene expression assays Promoter assays Two-hybrid screening: 반응하는 단백질 검출 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Green fluorescent protein (GFP) gene (reporter gene) GFP 1 GFP inserted into gene A. Gene A 2 Expression of gene A observed through GFP expression. GFP 3 Cells fluoresce when the GFP gene is expressed, indicating that the regulatory elements of gene A are turned on. Gene On Gene Off Green fluorescent protein produced No fluorescence (bottom left): Courtesy of Pamela Silver and Jason Karana, Harvard Medical School, Dana Farber Cancer Institute. Photo provided by Howell Martin

9.2. Applications of Genetic Engineering 진핵생물의 유전공학 효모(Yeasts)도 세균처럼 유전자조작 가능함 Transgenic: 유전자주입한 식물 또는 동물 식물에 살충단백질 유전자 주입: Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens used to generate corn, cotton, potatoes that produce Bt toxin from Bacillus thuringiensis 곤충과 애벌레(larvae)에만 독성나타냄. 제초제분해 유전자를 콩, 면, 옥수수 등에 주입하여 herbicide glyphosate (Roundup)를 분해시켜 토양보존. 효능개선 작물 생산: β-carotene함유 쌀 먹는 백신(edible vaccines)작물

9.3. Techniques Used in Genetic Engineering DNA library 염색체 추출하여 제한효소 처리 분해시킨 유전자 조각을 vector에 삽입 Transform vector를 대장균에 주입 원하는 유전자를 가진 콜로니를 선발

9.3. Techniques Used in Genetic Engineering Obtaining DNA(진핵세포의 DNA 얻기) 먼저 인트론을 제거후 mRNA 분리 cDNA로 역전사(Reverse transcription) Intron Intron Eukaryotic DNA Eukaryotic cell DNA Transcription of eukaryotic DNA generates pre-mRNA. mRNA Pre-mRNA Splicing removes the introns from the pre-mRNA, generating mRNA. mRNA mRNA extracted from cells mRNA (isolated) Isolated mRNA Reverse transcriptase synthesizes DNA from mRNA. cDNA Single strand of cDNA DNA polymerase completes the cDNA, free of introns. Double-stranded cDNA

9.3. Techniques Used in Genetic Engineering Generating a Recombinant DNA Molecule(재조합 DNA 만들기) Vector는 주로 plasmid 또는 bacteriophage Origin of replication 소유. 삽입유전자 소유 Restriction site(s) 소유 특히 Multiple-cloning site 소유하면 유리 Selectable marker 소유 예: Ampicillin resistance Second marker 소유하면 더 좋음. Fig. 9.8. Typical properties of an ideal vector.

9.3. Techniques Used in Genetic Engineering Second genetic marker 예: lacZ′ gene Product cleaves X-gal Forms blue compound Multiple-cloning site에 유전자 삽입 삽입되면 lacZ′ 기능상실 Intact vector  blue colonies Recombinant molecule  white colonies

9.4. 유전공학과 사회문제 신기술은 안전성 검증필요 미국립보건원(NIH)에는 30여년 전에 재조합유전자 고문위원회 (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) 신설. 많은 활동함: 유전공학의 악용될 가능성경고. 개인 유전자서열 공개: 윤리적 문제, 개인정보 보호 유전자조작식물(GMO): 전망 밝다 Allergen으로 작용 가능성 예기치 못한 결과 초래 가능성 Bt주입 식물의 꽃가루가 나비 멸종 가능성 제초제 저항유전자가 잡초에 전이 가능성

9.5. DNA Sequencing (유전자 서열분석) Human Genome Project 후 큰 발전 Genomics 분야에 큰 진전 다양한 종의 유전체 분석 달성 자료분석위한 생물정보학(bioinformatics)의 탄생 아미노산 서열분석법 발달 단백질 또는 생물을 서로 비교 가능해짐 생물의 진화수준을 비교가능. 장내미생물 분석위해 새로운 Human Microbiome Project추진.

9.5. DNA Sequencing (DNA 서열 분석법) Dideoxy chain termination 법 자동화 가능 In vitro DNA 합성 필요시약 Template DNA DNA polymerase Primer dNTPs (dA, dT, dC, dG) ddNTP (ddA, ddT, ddC, ddG) dideoxyAdenosine (ddNTP의 예) (dNTP의 예)

9.5. DNA Sequencing Dideoxynucleotides (ddNTPs) Serve as chain terminator로 작용 3′OH 결핍되어 합성 중지됨. 다양한 길이의 DNA가 합성됨. 실험순서: 1. Denature DNA 2. Separate ssDNA via electrophoresis 3. Read fluorescent label on ddNTPs to obtain sequence.

DNA 서열분석법 Sanger method 영국 캠브리지대학 1960-1970년대 발견 (Chain-termination method): 영국 캠브리지대학 1960-1970년대 발견 ddNTP 사용 (primer에 32P 동위원소) 1958년 노벨화학상: 단백질 아미노산 서열분석 1980년 노벨화학상: DNA 염기 서열분석 Maxam–Gilbert method 미국 하바드대학(Gilbert) 1977년 발견 1980년 노벨상 주형 외가닥 DNA에 32P 동위원소 부착후 염기 파괴시약 처리하여 전기영동으로 분석 4종류의 반응(G, G＋A, T＋C, C)

9.5. DNA Sequencing DNA염기서열 자동분석법 형광염기 사용 Laser로 형광색소 reading dNTP (A, T, C, G): 형광 미부착 ddNTP (A, T, C, G): 형광 부착 Laser로 형광색소 reading 컴퓨터로 서열 자동분석

9.6. Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA를 수백만배 증폭 gel electrophoresis후 확인. 특정서열만 증폭 배양없이 DNA만 있으면 가능 필요시약 주형 DNA primers polymerase deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

9.6. Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA 가열변성 (~95°C) Primer anneal (~50°C) DNA synthesis (~70°C) Heat-stable Taq polymerase from Thermus aquaticus

9.6. Polymerase Chain Reaction (PCR) Primers define length of PCR product

9.6. Polymerase Chain Reaction (PCR) Exponential amplification of DNA 일반적으로 ~30 cycles

Perspective 9.1. Science Takes the Witness Stand (과학자가 증인석에 앉다) Amplification of short tandem repeats (STRs, 짧은 직렬반복) Comparisons of 13 STRs allows unique identification 법의학(Forensics science)

9.7. Probe Technologies (Probe의 무한한 응용) DNA probes 외가닥 DNA 주로 합성하여 만듦 (주로 20-mer) 주형과 상보적 부위에 결합( hybridization) 동위원소 부착하기도 다양한 응용분야 적용 Colony Blotting Fluorescence in situ Hybridization (FISH) DNA Microarrays

9.7. Probe Technologies 1. Colony Blotting 원하는 유전자를 가진 콜로니를 검출

9.7. Probe Technologies 2. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) 슬라이드 글라스의 세포에 probe 처리하여 hybridize 시킴. 형광현미경으로 probe결합세포 분석: 배양없이 균동정 가능 Probe를 2종 이상 사용하면 2종류 균을 분석 가능: 서로 다른 색의 형광부착 응용: 세균동정: rRNA 결합 probe 사용 결핵진단: 객담중의 결핵균 검출

9.7. Probe Technologies 3. cDNA Microarray

9.7. Probe Technologies 3. DNA Microarrays 대조군과 처치군 mRNA 동량 혼합 유전자 발현을 분석 DNA 서열을 응용한 것 mRNA를 분리하여 cDNA로 만든후 array된 chip에 hybridization시킴. 대조군 mRNA: Cy-3(녹색형광) 처치군 mRNA: Cy-5(적색형광) 대조군과 처치군 mRNA 동량 혼합 칩에 경쟁적 hybridization 레이저 조사하여 적색이면: 유전자 발현 증가 녹색이면: 유전자 발현 감소 황색이면: 유전자 발현 불변 응용 Gene expression (diagnosis) Disease diagnosis (classification) Pathogen analysis (rapid genotyping) Drug Discovery

Microarray의 응용 DNA microarrays: cDNA, oligonucleotide and SNP microarrays MMChips: microRNA를 분석 Protein microarrays = Antibody microarrays (항체를 미리 coating) Peptide microarrays: peptide를 미리 coating (단백-단백 interaction) Tissue microarrays: 검체조직을 얇게 잘라 나열후 면역조직법, FISH 검사 Cellular microarrays (also called transfection microarrays): living cell을 지지대에 부착후 항체(단백, 지질)를 가하여 반응을 분석. Chemical compound microarrays: 막에 각종 화합물을 결합시킨 곳에 단백질 등을 가하여 반응여부를 측정. Carbohydrate arrays (glycoarrays): 탄수화물 분석 Tissue microarray Cellular microarray