MHC (major histocompatiblity complex) 검사의학교실 송은영

목차 [1] HLA란? HLA 분자의 구조 및 기능 HLA의 유전과 다형성 HLA 명명법 [2] HLA 형별검사 혈청학적 검사 분자유전학적 검사

HLA (Human Leukocyte Antigen) Class I 분자 (HLA-A, B, C) 대부분의 유핵세포에 발현 세포독성 T-림프구(CD8+)에 항원을 인지시킴. 이식거부반응 관계, 바이러스 감염 세포를 파괴 Class II 분자 (HLA-DR, DQ, DP) B 림프구, 활성화된 T 림프구, 단구, 대식세포, 수상세포 (dendritic cells), 미성숙 조혈세포, 혈관내피세포 및 일부 종양세포에 발현 보조 T-림프구(CD4+)에 항원을 인지시킴

HLA의 유전방식  HLA 유전자는 매우 가깝게 위치하여 한 덩어리 (haplotype, 일배체)로 유전됨. 부 모 자녀 B44 DR13 A11 B54 DR9 A3 B27 DR8 A24 B40 DR7  자녀 A2 B44 DR13 A3 B27 DR8 형제와 HLA가 일치할 확률 : 1/4

HLA 다형성 (polymorphism) 같은 유전자좌에서 생성된 분자가 2개 이상 종류로 존재하게 되는 것. 각 HLA 유전자좌에 많은 종류의 대립유전자가 있기 때문에 각 개체마다 다양한 HLA 항원을 갖음.   HLA는 사람이 갖는 유전자 중에서 가장 심한 다형성을 보임.        

HLA class I and class II polymorphism B C DRB1 DQB1 DPB1 Allele 수 (2009년 말) (2012년 3월) (2014년 7월) 965 1,757 2,884 1,543 2,338 3,589 626 1,304 2,375 762 1,166 1,540 107 162 664 138 152 422 Antigen 수 26 53 10 18 9 6 * HLA 다형성 (대립유전자, 항원 수준): class I : B > A > C class II : DR > DQ, DP * 한 인종에서는 일부 HLA allele 만 관찰됨: 한국인: A 40여종, B 60여종, DRB1 40여종

HLA 명명법 (by WHO Committee for HLA Nomenclature) ex) HLA-A2, B7, Cw1, DR4 HLA 대립유전자 ex) HLA-A*02:01, B*07:02, C*01:02, DRB1*04:05

International histocompatibility workshop에서 HLA 항원 명명법 International histocompatibility workshop에서 혈청학적 특이성이 정의된 순서에 따라 명명 split 항원(subtypic 또는 private specificity) 처음에 명명된 항원이 나중에 더 세분되어 명명되는 경우 세분화된 항원을 지칭 broad 항원 (또는 supertypic specificity) 세분화되기 전의 항원을 지칭 A9 → A23, A24 A24 항원 양성인 림프구는 A9 항혈청에도 양성반응을 보임.

Split Ag (2010)

HLA-A*29:01:01:02N HLA 대립유전자 명명법 <2004 명명법> HLA-A*29010102N Differences outside the coding region (introns) Signifies DNA Subtype HLA-A*29:01:01:02N Locus Type Silent Substitution Expression Corresponds to the serologic antigen or family <2004 명명법> HLA-A*29010102N <2010 명명법> HLA-A*29:01:01:02N

HLA 대립유전자 명명법 HLA-A*0201, Cw*0102, DRB1*0405 <2004 명명법> HLA-A*02:01, C*01:02, DRB1*04:05 <2010 명명법> 2010 명명법의 주요 변화 1) 영역 간에 colon(:) 사용하여 구분 2) HLA-C* (w 삭제): 대립유전자 명칭에는 w 삭제. (혈청학적 명칭에만 Cw 사용: complement C1, C2 등과 구별 위해) 2번째 영역(subtype)까지가 같으면 항원성(아미노산 서열)이 동일함. 보통 2번째 영역까지 보고함. 끝에 접미사 “N”이 붙은 경우 Null allele을 나타냄(예. A*02:53N). - 대립유전자는 있어도 항원이 발현 안됨. - 장기이식에서 해당 항원이 없는 것으로 취급해야 함. - HLA-A, B, C, DRB1에 각각 null allele이 수십개씩 보고되어 있음.

The HLA Dictionary Tissue Antigens 2009:73:95-170 1997, 1999, 2001, and 2004 (5th update)

Sero.(super.) Sero.(sub.) Allele GF 14 64 1401 2% 15 62 1501, 1507 11% 15 75 1511, 1502 2% 70 71 1518 1% 40 60 4001 4% 40 61 4002, 4003, 4006 8%

HLA 형별검사 혈청학적 검사 분자유전학적 검사 세포학적 검사 PCR-SSOP, Reverse SSOP PCR-SSP Microlymphocytotoxicity Test 분자유전학적 검사 PCR-SSOP, Reverse SSOP PCR-SSP PCR-SBT 세포학적 검사 Mixed Lymphocyte Culture (MLC) The polymorphism of the HLA molecules is determined by serological test using specific antibodies, cellular method such MLC and molecular analyses such as PCR-SSP (Sequence Specific Primers), PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes) and PCR-SBT (Sequence Base Typing). I am going to tell you more detail about PCR-SSOP.

Microlymphocytotoxicity test 원리: 보체의존성 세포독성검사 (complement-dependent cytotoxicity, CDC) 이용: 각종 항혈청(eg. anti-HLA-A2 Ab)이 분주된 microplate + 환자 림프구(HLA Ag) → 보체첨가 → cell lysis로 Eosin Y 침투 → 역위상차 현미경으로 관찰 . + 보체 + Cell lysis 염색약 침투

생존세포 90% 이상 생존세포 10% 이하

ASHI reading standard

HLA 분자유전학적 검사 PCR-SSOP Sequence Specific Oligonucleotide Probes PCR-SSP Sequence Specific Primers PCR-SBT Sequence Based Typing

검사의 해상도(resolution) 분류 Low (저해상도) 혈청학적 수준(serologic/generic) Intermediate 몇 개의 대립유전자군 (DRB1*0401/0421/0433/0434/0435/0438g) High (고해상도) 대립유전자 수준(allelic)

HLA 분자유전학적 검사 Class I Class II Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Typing region Class II Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Typing region

Reverse SSOP reverse SSO – line blot SSO probe가 스트립에 부착되어 있음. biotin 등으로 표지된 primer를 이용하여 PCR을 시행하고 고형상에 부착되어 있는 probe에 교잡반응(hybridization) 후 가시화(visualization)하여 판독함. 국내 시약현황 Murex INNO-LIPA, Dynal RELI 등 reverse SSO – Luminex SSO probe가 colored bead에 부착되어 있음 Streptavidin-PE로 표지된 PCR 산물과 교잡반응 후 판독 e.g.) LIFECODES HLA DNA (Tepnel Lifecodes)

Reverse-SSOP, line blot

Luminex corp. xMAP system www.rpciflow.org

SSP (sequence specific primer) 염기서열에 특이적인 primer를 이용하여 PCR 반응을 시키고 반응 유무에 따라 DNA 형별을 결정 국내 주요 시약 Biotest, One Lambda, Biosewoom 등 B*44/B*55

SBT (sequence-based typing) 고해상도 검사 class I (HLA-A, -B, -C): exon 2, 3, (4) class II (HLA-DRB1): exon 2 국내 주요 시약 Abott AlleleSEQR SBT kit, Biosewoom, In-house 등

HLA 형별검사의 Ambiguity 저해상도 vs 고해상도 - 저해상도: DRB1* 04 + 13 vs 04 + 14 Heterozygote vs Allelic - Heterozygote ambiguity: allele 1+2 = 3+4 A*0201+2402 = 0204+2452 = 0270+2429 - Allelic ambiguity: allele 1(=2) + 3 A*0201/04/70, *2402/29/52 * Heterozygote ambiguity > Allelic amibiguity

Heterozygote ambiguity International Histocompatibility Working Group (http://www.ihwg.org/protocols/sbt/ambiguities2.pdf)

세포학적 검사 MLC (mixed lymphocyte culture) In vitro measure of class II disparity (주로 HLA-DR 분자에 대한 반응) 표준화가 어려워 분자유전학적 검사로 대치됨.

장기이식의 조직적합성 검사 검사종류 (1) ABO 혈액형 (2) HLA-A, B, DR (3) HLA crossmatch (4) PRA (5) MLC 장기이식에서 검사의 적용 solid organ : ABO 혈액형, HLA crossmatch 가장 중요 신장, 췌장 - HLA match 고려 bone marrow (HSC) : HLA matching 가장 중요 ABDR full match (1 antigen mismatch) 혈연 : serologic (≒allele) level match 비혈연 : serologic (≠allele) level match