유기산(Organic acid) Organic acid R-COOH Acetic acid Lactic acid Citric acid Gluconic acid : Ca or Fe염 - 결핍증 치료제 피혁산업 - 산성화제 Itaconic acid : 접착제, 종이제품, 직물제조용, 플라스틱 – 중합체 제조용 EMP(Embden-Meyerhof-Parnas) pathway HMP(Hexose monophosphate) shunt TCA(Tricarboxylic acid) cycle http://bioenv.sunchon.ac.kr

젖산(Lactic acid, CH3CHOHCOOH) 젖산의 이용 Free Lactic acid 식품 : 식품보존제, 산미제, 반죽개선제제 mild acidic flavor, 식품 자체의 향미를 해치지 않음 물과 혼합이 쉬움, 미생물 억제 작용 산업용 : 피혁, 섬유, 세탁 Lactate Ca-lactate : baking powder, Ca-fortified food Na, K-lactate : 담배의 습도 유지, 혹한시 윤활유 Ester 수성, 유성 페인트 용제

젖산의 생성 Glucose –(EMP, HMP, TCA)→ Pyruvic acid Pyruvic acid + NADH + H+ -(lactate dehydrogenase)→ Latic acid + NAD+ 동물, 식물, 미생물에 의해 생성 근육 : L-형 젖산 생성 젖산균(Lactic acid bacteria, LAB) L-, D-, DL-형(lactic acid racemease) 젖산 생산 곰팡이(Mold) Rhizopus oryzae, Mucor rouxii L- 형 젖산 생산

젖산균(Lactic acid bacteria) Lactic acid bacteria (LAB) 당류를 발효하여 젖산을 유일한 또는 중요한 발효산물로 대량 생산하여 세포 밖으로 배출하는 세균들 (대당수율 50% 이상) 그람 양성의 간균 또는 구균 통성혐기성, 미소호기성, 내산소성 혐기성 또는 절대혐기성 Catalse(-), cytochrome(-) 영양요구성이 까다롭다(fastidious nutritional requirement) 가성 젖산균(pseudo lactic acid bacteria) Escherichia coli : Gram (-)

중요한 젖산균 속 Lactobacillus Leuconostoc Lactococcus Streptococcus Pediococcus Enterococcus Bifidobacterium

동종젖산발효와 이종젖산발효 동종젖산발효(Homo-lactic fermentation) 당류로부터 유일한 발효산물로 젖산을 생산하고 소량의 부산물 생산 C6H12O6 (glucose) → 2CH3CHOHCOOH (lactic acid) Lactococcus 속, Streptococcus 속, Pediococcus 속, Enterococcus 속의 전부 Lactobacillus 속의 일부 : L. delbruekii, L. bulgaricus, L. acidophilus, …

이종젖산발효(Hetero-lactic fermentation) 당류로부터 젖산을 중요한 발효산물로 생산하지만 ethanol, CO2 등도 함께 생산함 C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2 Leuconostoc 속 전부 Lactobacillus 속의 일부 L. brevis, L. kefir, L. pentaoaceticus Bifidobacterium 속 : acetic acid와 lactic acid를 3:2의 비율로 생성 가성젖산발효 (Pseudo-lactic fermentation) Escherichia coli 2C6H12O6 + H2O → 2CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CH3COOH + 2CO2 + 2H2

세균과 곰팡이를 이용한 젖산 생산 비교 Short period Expensive raw material Less contamination (thermophilic LAB) L-, D-, DL-form Anaerobic fermentation Longer period Cheap raw material Only L-form Aerobic fermentation Easy separation of cells after fermentation

세균을 이용한 젖산 생산 생산 균주 발효조 배지 정상젖산발효, 호열성 Lactobacillus delbruekii : 50℃, starch, glucose Lactobacillus casei, L. bulgaricus : 44℃, whey 발효조 내부식성 재질 : stainless steel with high Mo content 배지 젖산균 : 복잡한 영양요구성 (nutritionally fastidious) 탄소, 에너지원 : 설탕, 포도당, 유청(whey, lactose), molasses 전분(당화 필요함) 질소 및 기타 : malt, malt root, corn steep liquor * 완전한 멸균 필요 없음 : 다량의 접종원 사용, 높은 배양 온도

발효 젖산의 회수 온도 : 45 ~ 50℃ pH : 5.5 ~ 6.5 (CaCO3 또는 Ca(OH)2로 유지) 기간 : 3~6일, 잔당 < 0.1%(12%)일 때 정지 젖산의 회수 CaCO3 첨가 → pH 10 ~ 11 → calcium lactate(soluble) 가열 : 균체 사멸, 단백질 침전, 잔당의 분해 냉각, 여과 H2SO4 첨가 : Ca-lactate + H2SO4 → Lactic acid + CaSO4(↓) 탈색(활성탄소), 여과, 농축

H2C-COOH 구연산(Citric acid) 구연산의 이용 ı HOC-COOH TCA 회로의 중간산물 Citrus fruit Aspergillus niger 구연산의 이용 식품 : 탄산음료, 과일쥬스, 잼, 젤리, 캔디, … 플라스틱 : 저독성 식품포장용 화장품 : lotion, hair rinse, hair setting fluid 의약품 : Fe-citrate 페인트, 분해성 세제, 도금, 녹 제거, …

TCA(tricarboxylic acid) cycle에서 구연산 축적 Acetyl-CoA ↑ Glucose → Pyruvic acid : EMP > HMP Pyruvic acid + CoA-SH → Acetyl-CoA + CO2 (pyruvate dehydrogenase complex) Pyruvate + CO2 → Oxaloacetate ↑ Acetyl CoA + Oxaloacetate → Citric acid ↑ citrate synthetase (condensing enzyme) Citric acid → cis-Aconitate → Isocitrate↓ aconitase Isocitric acid → α-ketoglutarate + CO2 ↓ isocitrate dehydrogenase

구연산 생산균주 From sugars From Hydrocarbons Aspergillus niger, A. awamori, A. saitoi Penicillium citrinum Trichoderma viride (from cellulose) From Hydrocarbons Candida lipolytica, Candida tropicalis Arthrobacter paraffineus 탄화수소를 이용한 구연산 생산 - 높은 수율 : C6H12O6 + 3/2 O2 → C6H8O7 + 2H2O (106.7%) 6CH2 + 9/2 O2 → C6H8O7 + 2H2O (228.7%) - 낮은 용해도, isocitrate 생산량 증가 (aconitase 저해제 및 저항성 변이주 사용)

구연산 발효 발효방법 배지 발효관리 고체배양, 액체 표면배양 액침배양(submerged culture) 당 함량이 높을 것 인산 함량이 낮을 것 질소원 함량이 낮을 것 미량 원소가 결핍될 것 : Fe, Zn, Mn, Cu, Mg, Mo 발효관리 통기 ↑ pH : 5~7 → 2~4 → 2.0 이하 높으면 오염도 증가 구연산 생산 감소, oxalic acid & gluconic acid 생산

구연산 회수 균사체 및 oxalic acid 제거 CaO(석회) 첨가 및 여과 낮은 pH에서 Ca-oxalate 침전 구연산은 Monocalcium citrate(dissolved) 3. 구연산 침전 CaO 계속 첨가, pH 7.0 ~ 7.4, 70 ~ 90℃ 구연산은 Calcium citrate로 침전 4. Calcium citrate 침전물 여과 분리 5. 구연산 가용화 H2SO4 첨가 – CaSO4 침전물 제거, Citric acid 회수 6. 활성탄소, 양이온 교환수지, 음이온 교환 수지 처리 7. 수분 증발 및 결정화