KNU Microbial Biotechnology Laboratory

Presentation on theme: "KNU Microbial Biotechnology Laboratory"— Presentation transcript:

1 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
경북대학교 미생물공학연구실 KNUmbl 14장. 용매발효 응용생명과학부 생명식품공학전공 박 희 동 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

2 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
14-0. 용매와 주정 * 용매: 주정, glycerol, acetone·butanol 등의 생산을 목적 └ 합성법에 의해 대부분이 생산 * 주정과 에탄올 1) 주정(wine spirit): 에탄올을 85%(v/v) 이상 함유하는 방향의 무색 액체 (15℃의 비중: ) %(v/v) = 1 도 = 2proof * 우리나라 주세법상 95% 이상 - 음료, 도료, 염료 등의 원료, 기타 화학공업 2) 에탄올: 순수한 화학성분을 칭함 - 실제 순수하게 제조 못하나 성분을 위주로 얘기할 때 - 시약 등 * 주정의 종류 1. 발효주정: 발효에 의해 생산된 주정 -음용 및 일부는 공업용으로 사용 2. 변성주정(공업용주정): 주정에 메탄올과 색소를 첨가 -음용으로 사용 못하게 제조: 용매, 연료 3. 합성주정: 화학 합성에 의해 제조된 주정 -공업용으로만 사용 C2H4(ethylene, CH2=CH2) + H2O → C2H5OH(ethyl alcohol) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

3 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
14-1. 알코올발효의 원리 1) 이론적 에탄올 생성비 : 대전분: 92.14/162.14, 대당: 92.14/180.16 - 원료의 무게로부터 생성되는 에탄올의 무게 추정 가능 - 무게 또는 부피(15℃일때 비중 ) 가) 증류법에 의한 알코올 농도 측정 : 100ml 증류하여 약 80ml 회수 후 증류수로 100ml 정용 - 15℃ 냉각 후 주정계로 눈금 (부평법) - 주정도 온도 보정표로 보정할 수 있음 나) 에탄올 생성량과 CO2 생성량의 관계 에탄올 생성량 g = CO2 생성량 × 92.14/88.02 : CO2 감량법-발효중 무게 감소 측정 (기체 산물 : CO2 + H2O - 황산으로 H2O 포집 -CO2 감소량) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

4 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
2) 발효율 (fermentation ratio, %) : 이론적 에탄올 생성량에 대한 실제 알코올 생성량 % - 약 87~95% - 효모의 생육에 약 2-4%의 당이 소비 가) 이론적 알코올 생성량 : 당 함량으로부터 알코올 fid(l)으로 환산 : 담금 술덧의 총당 % (w/v) ÷ 100 × 용량 (l) × 92.14/ ÷ (당의 양 kg) (대당 알코올 생성비) (비중) * 비중으로 나누기 전의 값 : 알코올 량(kg) 나) 실제 알코올 생성량 : 숙성 술덧의 알코올 함량과 술덧의 양으로부터 환산 : 숙성 술덧의 알코올 함량 % (v/v) ÷ 100 × 용량 (l) (술덧을 증류하여 얻은 분석치) * 술덧: 담금 후부터 발효 종료까지 혼합물 – 담금 술덧, 숙성 술덧 (원료에 효모 혼합하여 발효 유도) - 담금 술덧과 숙성 술덧 용량의 차이 : 발효에 의해 원료가 분해 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

5 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
14-2. 당질원료에서의 주정발효 * 주정발효의 원료 1) 당질원료 음용-당밀(주 사탕수수), 사탕수수 즙 또는 농축즙, 대추야자 열매 공업용 - 폐당밀 (설탕 분리 후 남은 찌꺼기), 아황산 펄프 폐액(주로 침엽수) 2) 전분질원료: 음용 -효소에 의한 당화 공정 곡류: 옥수수, 보리, 쌀, 조, 피, 서류: 고구마(생-, 절간-), 타피오카(카사아버 가공품), 감자, 돼지감자 3) 섬유질원료: 목재 및 농업 폐기물 산당화(H2SO4, HCl)하여 이용 -공업용 -겨, 볏집, 고구마 덩굴 1. 회분식 발효: 제한된 기질로 1회 발효 원료당밀 희석 발효조성제 첨가 살균 발효 증류 및 정제 유안, 쌀겨 주모제조 가. 주모(술밑, seed mash, motto) : 효모를 확대 배양한 것 -잡균오염 억제하며 안전하게 효모를 배양하는 것이 중요 -당밀을 총당 10%로 희석 – 유안 첨가 (0.5-1g/l) - 황산으로 pH4.5 조절 -살균 후 효모(S. cerevisiae, 이전 S. formosensis) 접종 -30℃ 2일 배양 - 초기 시간 통기 (통기량 0.01V/min) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

6 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
나. 발효 : 주모 발효조 이동 + 총당 16%의 당밀 희석액 (pH 4.5) -30-35℃에서 2일 발효 – 약 8%의 알코올 함유 * 최근 고농도 술덧 발효법 연구 : 시설비 및 운전경비 감소, 관리 용이 2. Melle-Boinot 법 : Reuse 연속법 –증류 전 술덧으로부터 효모 회수하여 다음 발효 사용 -회수 효모: pH2.5조절 후 2시간 방치 - 잡균 도태 - 3개월 마다 효모 바꿈 3. 연속발효법 1) 다단식 연속 발효법: 브라질, 아르헨티나, 유럽 각국 - 4-8개의 발효조를 직렬 연결 - 1-2단: 저 에탄올, 저당농도에서 통기하여 효모 생육 촉진 - 균체 재이용 - 뒤의 조에 고농도의 당액 공급하여 고농도 에탄올 발효 가능 2) 고정화 효모에 의한 연속 발효 : 고정화 효모를 발효조에 충진하고 하부로부터 당액 공급 - 당액이 상승하면서 발효 진행 (하부: 저알코올, 고당, 상부: 고알코올, 저당) - 상부로부터 발효액 회수 및 증류 4. two stage법(Hildebrandt-Erb법) - 증류 폐액(상당량의 비발효성당 함유)을 가수분해하여 효모증식에 이용 * 주정 증류 폐액의 처리 예 : 폐액 – 원심분리 – 침전물은 건조하여 사료 이용 : 여액은 농축 후 건조하여 침전물 건조 사료에 첨가 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

7 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
14-3. 전분질원료로부터 주정발효 * 당화제 : 전분질 원료의 경우 반드시 당화 -amylases 혼합 1) 국 (코지, koji): 증자곡류에 순수한 형태의 국균 곰팡이를 번식시킨 것 - 일본 2) 누룩 (곡자, Kokja, Nuruk): 밀기울에 곰팡이를 번식시킨 것 - 한국 - 자연 곰팡이, 효모 다량 함유 - 주로 Aspergillus 속과 Rhizopus 속 3) 맥아(엿기름, malt): 보리를 발아시킨 것 - 각종의 효소 함유(amylase, protease, glucanase) 4) 산당화: 산의 존재하에 가열 - 섬유질 원료 경우 주, 전분 경우 거의 사용 무 - 염산, 황산 5) 효소제: 액화효소 및 당화효소 - B. subtilis의 α-amylase와 Rhizopus sp.의 glucoamylase * 발효방법 : 당화(곰팡이 당화형 amylase 사용) 방법에 따라 7 가지로 분류 국법(koji법), amylo법, amylo주모 코오지절충법, 코오지주모 효소법, 효소법, (맥아법, 산당화법) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

8 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
1. 원료의 증자 : 호화 목적 -효소의 작용 용이 1) 회분식 증자법 : 회분식 가압증자 - 증자솥 이용 : 2-4Kg/cm2 * 분 2) 연속식 증자법 : 미세하게 분쇄한 원료와 물을 혼합하여 slurry 제조 - 증자관을 통과시키면서 증자 ℃ * 3-6분 처리 3) 연속 저온 증자법: 원료, 내열성 액화형 amylase (B. subtilis) 혼합 - 85℃ * 30 분 액화 후 증자기로 보내어 105℃에서 60분간 증자 2. 발효 : 전분의 경우 반드시 당화 공정 필요 가. 국법(코지법) : 주모제조, 발효를 위한 전분질 원료를 당화 국을 사용 - 증자 후 액화 및 당화 1) 고체국법(피국법, 밀기울 코지법): 고체상의 코오지를 효소제로 사용 : 밀기울과 왕겨 6:4로 혼합한 것에 국균 번식시켜 국 제조 * 국균으로 A. oryzae, A. shirousami 주로 사용 * 종국 : 국의 제조를 위해 첨가하는 국균 배양물 : 주모: 코오지 당화 후 젖산발효 또는 젖산 첨가하고 살균 후 효모배양 - 술덧의 5~10% 주모 사용 : 발효- 국 유래 잡균 때문 왕성하게 단시간에 발효 -보통 48시간에 종료 2) 액체국법(액국법): 액체상의 국을 효소제로 사용 액체배지에 국균(흑국균: A. awamori, A. niger, A. usami) 번식시켜 국 제조 - 밀폐된 배양조에서 배양하여 무균적 조작 가능, 피국법보다 능력이 감소 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

9 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
나. Amylo법 : 원료에 직접 amylo균을 배양하여 당화시키는 방법 - 따로 주모를 제조하지 않고 원료 당화 후 바로 발효조에 효모 배양액 접종 당화 발효 전분 증자액 당 EtOH : 한 개의 발효조에서 2단계 진행 amylo균 효모배양액 장점: 간단하고 편리, 한 개의 발효조 사용, 잡균오염의 위험 감소 단점: 발효속도 지연, 관리 곤란, 발효액의 알코올 농도가 낮음 1) 원료 : 충분한 질소 함량이 중요 - amylo균의 증식, 당화력에 영향 - 유안, 쌀겨등과 혼합하여 질소원 보충 2) Amylo균 : Mucor rouxii(= formerly Amylomyces rouxii)를 사용하여 개발 - 현재 R. delemar(곡류), R. javanicus (서류) 포자를 접종하여 배양 - 포자 생산: 멸균한 5~8mm 두께 감자 절편 표면에 amylo균 접종하여 배양 - 최적 37-38℃ 유지 3) 효모 : S. cerevisiae (이전에는 S. anamensis 사용), S. cerevisiae 발연1호 - amylo균의 생육 적온에서도 잘 발효(35~38℃) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

10 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
다. amylo 주모 국 절충법 주모의 제조를 위해서는 amylo법, 발효를 위해서는 국법으로 전분질 원료 당화 고체국: amylo 주모 고체국 절충법 -- Asp. oryzae, Asp. shirousami 액체국: amylo 주모 액체국 절충법 -- Asp. awamori - 주모 배양 시 잡균오염 감소, 발효속도 양호, 알코올 농도 증가 라. 국 주모 효소법 ; 주모 제조에 코오지 이용 및 담금에는 효소이용 원료처리 : 액화효소 처리 및 증자 - 연속저온증자 주모 : 증자원료에 코지(주로 액체 코지)와 효모 첨가하여 배양 주요 : 증자원료에 당화효소 첨가하여 당화 (60℃ * 1-2 시간) - 당화 후 주모를 첨가하여 발효 유도 * 액화효소 : B. subtilis의 a-amylase, 당화효소 : Rhizopus sp.의 glucoamylase 마. 효소법 : 주모제조와 담금에 모두 당화효소 사용 -고구마를 원료로 할 경우 산업화 되어 있음 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

11 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
14-4. 증류 1. 증류이론 : 증류(비등과 응축) * 증류: 주정분을 물과 분리하여 농축 : 술덧 중 6~9% - 주정에 95% 이상 함유 - 에탄올, 물 혼합액 가열 시 에탄올 먼저 휘발하여 증기의 에탄올 농도 증가 (100% 에탄올 비점: 78.3℃, 물 비점: 100℃) - 응축하여 증류액 제조 : 에탄올 농도 증가, 비점 감소 - 일정 농도가 되면 에탄올 농도와 비등점이 일정한 값에 도달 * 공비점: 증류를 계속하여도 주정농도와 비점의 변화가 없을 때의 비점 - 증류 시 용액과 증기의 조성이 일치할 때의 비점-물과 에탄올 동시 비등 비점: 78℃(100% 에탄올 78.3℃), 응축점: 15℃, 주정분: 97.2 % (v/v) = % (w/w) - 이 때의 혼합물을 공비혼합물 - 증류로 더 이상 알코올의 농도 증가 불가능 가. 알코올 증발계수(Ka) : 증기 중의 알코올 농도 % / 용액 중의 알코올 농도 % - 용액 중의 알코올 농도가 높아지면 알코올 증발계수는 감소 - 공비점에서는 일정 : Ka = 1.0 나. 정류계수 : Kn/Ka (불순물의 증발계수(Kn)와 알코올 증발계수(Ka)의 비) 정류계수<1.0 - Kn<Ka : 증기 중 불순물 농도가 용액 중 농도보다 감소: 정제 = = : 와 동일 > > : 보다 증가 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

12 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
* 비등응축 곡선 : 증류 시 비점에 대한 용액과 증기의 알코올 농도 변화 곡선 - 증류를 계속하게 되면 그 때의 비점과 알코올의 농도가 이 곡선과 일치 혼합액 알코올 %(v/v) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 95 비등점 (℃) 100 92.50 87.50 85.00 83.75 82.50 81.25 80.00 79.38 78.75 - 증기중 51.00 66.20 69.20 71.95 74.95 78.17 81.85 86.49 91.80 95.35 증발 계수 Ka 5.10 3.31 2.31 1.80 1.50 1.30 1.17 1.08 1.02 1.004 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

13 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
2. 증류장치 가. 단식증류기(pot still) : 술덧을 가열하며 생성되는 증기를 냉각하여 채취 - 술덧 가열관, 응축기, 예열기(옵션) - 고형분, 수용성 비휘발성 성분 제거 - 휘발성 불순물 제거 곤란 : aldehyde, ester, fusel oil, 휘발산-독특한 향미(증류주) * 퓨젤유 주성분: 고급알코올, 미량성분(고급지방산에스테르, 푸르푸랄, 아민, 지방산) 나. 연속식 증류기(patent still) : 탑의 상단으로부터 술덧 일정량 공급 - overflow pipe를 통해 하단으로 이동, 하단으로부터 증기 취입 - 증기가 통기관을 통해 위로 상승하며 시렁의 술덧을 가열하여 증기 발생 - 상단 : 고 알코올, 하단 : 저 알코올 - 탑 정상의 증기는 냉각기로 응축하여 알코올로 유출 CH3-CH-CH2OH CH3 iso-butyl alcohol : Val 유래 : 10% CH3-CH2-CH-CH2OH Active amylalcohol 2-methyl-1-butanol : Ile에서 유래 : 5% CH3-CH-CH2-CH2OH iso-amyl alcohol: Leu 유래 = iso-pentyl alcohol = (3-methyl-1-butanol) : 45% KNU Microbial Biotechnology Laboratory

14 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
-단식증류기(위스키용) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

15 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
-단식증류기(브랜디용) KNU Microbial Biotechnology Laboratory

16 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
-연속식 증류기 : 연속증류탑 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory
* 연속증류탑의 구조 및 기능 1) 술덧탑 : 3-11개의 술덧탑으로 구성 : 각각에 응축기 부착 - 탑 내부 여러 개 시렁 (보통 17단) : 아래로부터 증기 취입(하부고온) - 술덧을 탑 상부로 공급하여 가열, 동시에 증기를 회수하여 응축기로 보냄 - 증류 폐액 : 바닥으로 배출 - 고형분이나 비휘발성 성분 2) 응축기(열교환식 냉각기) 및 가스분리기 -- 3개의 응축기로 단계적 응축 : 응축기 - 냉각수 양 조절하여 알코올 응축, 저비점 성분은 응축 불가 acetaldehyde(bp= 21ºC), 메탄올(64.7ºC) : 가스분리기 : 일부를 개방하여 CO2, 저비점 성분 기체상태로 공기 중 휘발 3) 퓨젤유(fusel oil) 분리기 (농축탑) : 알코올의 %가 퓨젤유 : 퓨젤유의 정류계수 (Kn/Ka) = 알코올 농도 42~43%에서 1.0 - 증류 시 퓨젤유는 알코올 42~43% 농도의 것에 존재 - 이 농도의 알코올 회수하여 20% 이하 희석 -퓨젤유가 기름처럼 부상 –제거 4) 추출탑: 가수증류(추출증류) : 불순물 많은 부분 회수 희석(10%)하여 재증류하여 불순물 제거 5) 정류탑 : 알코올을 농축하여 회수 - 농축부와 회수부로 구성 - 상단(저온) : 고알코올, 하단(고온) : 저알코올 (정류탑으로 환류) 6) 정제탑: 96%의 알코올에 함유된 소량의 메틸알코올과 저비등점 성분의 제거 7) 불순물 처리탑 : 탑 정상부 저비점 불순물 함유 부분을 농축하여 불순물 제거 - 불순물 제거하고 남은 액을 술덧탑으로 순환 KNU Microbial Biotechnology Laboratory