Molecular Biological Tools in the Environmental Engineering The value of applying molecular biological tools in environmental engineering Soil Quality Laboratory 2009. 1. 13.

What are values of MBTs in EE? To develop a fundamental understanding of microbial communities in order to optimize process To replace existing culture-based screening technique for microorganisms (e.g. coliform testing of portable water) in case of bioremediation, MNA (Monitored Natural Attenuation), biological wastewater treatment, anaerobic digestion, and so on.

Bioavailability, Mass transfer 미생물을 이용한 정화기술의 발전 Bioavailability, Mass transfer 토착미생물에 의한 자정작용 (Intrinsic bioremediation) Back to microbial ecology 순수분리균 이용한 현장 정화, Superbug 이용한 반응조 정화 (Bio-manipulation) consortium의 중요성 타 미생물과의 상호작용 미생물-오염물질-토양 상호작용 -> 토착미생물 분해능 향상 도모 (Engineered bioremediation)

MBTs in EE - Example Examples of bioremediation and MNA From EPA Research Highlights  Examples of bioremediation and MNA 특정 물질을 분해할 수 있는 미생물이 해당 site에 존재하는가? (계통학적 분석 – phylogenetical analysis) 해당 site의 미생물들이 특정 물질을 분해하는 효소를 만드는가? (기능 분석 – functional gene analysis)

Objectives for this presentation 특정 미생물이 있는지, 그 분율은 얼마인지 알아내는 기술 실제 오염물질을 분해하는 효소가 생산되는지, 그 조건은 어떤 것인지 알아내는 기술 위와 같은 분자생물학적 기술들을 환경공학에서 어떻게 적용하고 있는가?

1. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) 개념 정리 1. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) 생물체가 살아가기 위한 유전정보를 담고 있는 매체, 다음 세대로 ‘유전’됨 Cytoplasm 내에 꼬인 상태로 존재하거나 (chromosomal DNA) ribosome, mitochondria에 독립적으로 존재 < Prokaryotic cell structure>

개념 정리 Adenine, guanine, cytosine, thymine의 4 가지 base의 서열로 유전정보 결정됨 A G C T A G C T G A G A G C T T C G A T C G A C T C T C G A 5’ 3’ 풀어서 보면 Adenine, guanine, cytosine, thymine의 4 가지 base의 서열로 유전정보 결정됨 A = T : 이중결합 G ≡ C : 삼중결합 Base는 서로 상보적 (complementary) 결합 bp: DNA의 길이 단위 < Double-helical DNA>

개념 정리 DNA RNA Protein Transcription Translation 3개의 base가 하나의 amino acid 생성 (alanine- phenylalanine-arginine-..) Amino acid sequence → protein (enzyme; dioxygenase, monooxygenase..)

2. 16S rRNA gene in Molecular systematics 개념 정리 2. 16S rRNA gene in Molecular systematics Ribosome 50S mRNA Transcription C U G 30S T C G A T C G A C T C T C G A 5’ 3’ 16S Ribosome으로 tRNA가 전사된 RNA 사슬을 운반하여 ribosome 내에서 translation Ribosome의 구성 성분을 이루고 있는 것이 ribosomal RNA 모든 bacteria가 가지고 있다 중요한 기능을 수행하기 때문에 진화적으로 잘 보존된 부분 → 이 부분의 염기서열 분석으로 계통학적 분류 가능 약 1600 bp 정도의 크기

개념 정리 The secondary structure of 16S rRNA gene

3. PCR (Polymerase Chain Reaction) 개념 정리 3. PCR (Polymerase Chain Reaction) Primer PCR <원하는 부분만 DNA 증폭> DNA의 양을 늘리는 반응 - duplication 반복, 대수적 증가 - Taq polymerase 사용 DNA 중 원하는 부분만을 증폭 가능 - primer DNA의 melting temperature = anealing temperature 의 원리를 이용함

Microbial Community Dynamics From EPA Research Highlights  특정 물질을 분해할 수 있는 미생물이 해당 site에 존재하는가? 존재한다면, 전체 미생물 군집 중 비율은 얼마나 되는가? (PRB의 경우) 설치 전, 후, 설치 지점에서의 미생물 군집 변화는 어떠한가?

Microbial Community Dynamics 1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) - DNA의 G+C %에 따라 band 분리됨 : 즉 각 band는 다른 bacteria 나타냄 - Microbial community의 pattern 분석에 사용 < Comparative DGGE band profiles of the denitrification consortium and some cloned samples >

Microbial Community Dynamics 2. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)

Microbial Community Dynamics 3. PLFA analysis (PhosphoLipid Fatty Acid analysis)

Microbial Community Dynamics 4. FISH (Fluorescence in situ Hybridization) - Each FISH probes labelled with different fluorescent dyes have been used to simultaneously identify the structure of microbial community <Three-color fluorescent in situ hybridization image of bacteria>

Microbial Community Dynamics 5. Clone Library PCR 16S rDNA Extracted DNA Ligation Plasmid에 sample DNA 집어넣음 E. coli 사용, 각 cell마다 plasmid가 하나씩 들어감 transformation

Microbial Community Dynamics Culture 각 colony 로 분리 각자 배양하여 sequencing

Microbial Community Dynamics 6. SIP (Stable Isotope Probing) C 13 - labeled substrate serum vial soil sample SIP (Stable Isotope Probing)

Functional Gene Analysis From EPA Research Highlights  해당 site에서 실제 효소의 활성 정도가 측정되는가? 오염 물질 분해/처리 정도에 따라 효소의 활성이 변하는가? 그것을 정량적으로 측정할 수 있는가?

Functional Gene Analysis 1. Real-time PCR 이제까지의 endpoint analysis에 기초한 PCR 법은 DNA의 분율을 정확히 나타내지 못함 그러므로 초기 DNA의 각 분율당 양을 정확히 알아내는 기법 필요

Functional Gene Analysis 매 cycle 마다 증가하는 DNA의 양을 측정 전체 DNA 중 target DNA의 증가량을 측정할 수 있음

Functional Gene Analysis

Functional Gene Analysis 2. Microarray A technique for determination of the expression patterns of specific genes Employing "chip technology" where tens of thousands of DNA or protein molecules are arrayed High-throughput method

Functional Gene Analysis 3. Dot blotting Slot-Blot Analysis를 이용한 TPH-degrading gene의 활성 측정 Probes Samples 농도별 standard 30 ng 20 ng 10 ng 5 ng 각 spot의 image 분석을 통해 calibration curve를 작성하여 sample에서의 각 효소 유전자 농도 측정 가능 slot-blot analysis 장치 Probe Compounds targeted Target gene alkB alkane Alkane hydroxylase (alkane 1-monooxygenase) nahA naphthalene Naphthalene dixoygenase nahH catechol Catechol 2,3-dioxygenase todC BTEX Toluene dioxygenase xylA toluene, xylene Xylene monooxygenase (Stapleton and Sayler, 2000년) 현장실증실험에서 유류분해와 분해관련 유전자 활성 간의 상관관계 보고

Functional Gene Analysis 4. Biosensor Reporter gene Promoter 오염물질에 의해 induction되는 promoter Lux, gfp, lacZ 생물학 적인 재료 및 기작을 이용하는 센서 시스템 전체를 의미 - 다양한 매체에서 오염물질의 농도 측정 가능

Functional Gene Analysis 5. Metagenome Soil plate cultivation 1,000 novel genes 10 novel genes lysis - clones Mechanical agitation

Functional Gene Analysis 6. RNA Work RNA (A, U, G, C로 이루어져 있음) extraction 후 역전사 (reverse transcription) 시켜 cDNA로 만든 후에 실험 DNA RNA Protein Transcription Translation DNA work: 어떤 일이 일어날 것이라는 ‘potential’ 을 알 수 있음 RNA work: 실제 어떤 일이 일어날 것이라는 예측 가능 Protein work: 실제 어떤 일이 일어나고 있다는 증명 가능

Functional Gene Analysis 7. Proteomics

Functional Gene Analysis 처리 전후의 단백질 발현 정도 차이 분석 (2-D Gel analysis) pI H               1 H3N(+)- C - COO(-)               1               R 생리적 pH 범위에서는 amphoteric, charge가 0이 되는 지점의 pH, 침전 일어나 분리 가능 MW <before treatment> <after treatment>