∘ 체세포분열과 생식세포분열의 특징을 비교하시오. 고찰 ∘ 체세포분열과 생식세포분열의 특징을 비교하시오. 체세포분열 생식세포분열 (감수분열) 분열 장소 모든 체세포 생식기관 분열 횟수 1회 연속 2회 딸세포 수 2개 4개 염색체 수변화 처음과 같다.(2n -> 2n) 처음의 반으로 줄어든다.(2n -> n) 분열 결과 생물이 생장 (몸의 크기가 커짐) 생식세포 형성 (새로운 개체 형성)

∘ 체세포분열과 생식세포분열의 특징을 비교하시오. 고찰 ∘ 체세포분열과 생식세포분열의 특징을 비교하시오. 1) 체세포분열 - 생물의 몸을 이루고 있는 세포의 생장을 위한 분열 - 모든 유전물질은 모세포와 딸세포에 똑같이 들어있다. - 세포분열 후에도 염색체의 수는 변화가 없다. (2n -> 2n) 2) 생식세포분열(감수분열) - 생식기관에서 생식세포를 형성할때의 세포분열 - 염색체수는 제1분열때 반감되고 연속 2회분열을 통하여 4개의 딸세포형성 - 염색체수가 반으로 줄어드는 세포분열 (2n -> n)

공지사항 이번주 결과레포트, 다음주 예비레포트 제출 (X), 최종적으로 레포트 제출시 제한효소(예비) + 전기영동(예비) + 제한효소&전기영동(결과 종합적으로) =6/14 (수), 5 시 까지 제출 2. 기존에 다 쓴 레포트도 모두 제출 바랍니다. (2. 세포 구성분자의 확인 ~ 13. 전기영동) -2권 이상일 경우도 모두 제출 (미제출시 점수 인정 불가-학교 공식 자료 약 2~3 년 보관 의무) 3. 6/12 실험 기말고사

가천대학교 생명과학과 생물학 및 실험 1 2017-1학기 생물학 및 실험 1 Exp 12. DNA의 정제 및 제한효소 처리

목적 DNA isolation - 세포에 있는 DNA를 연구 등의 목적으로 분리 할 수 있다. - Genomic DNA, plasmid DNA에 대해 이해 할 수 있다.

서론 (DNA Extraction) DNA isolation - Genomic DNA, plasmid DNA Plasmid DNA isolation = Mini/Midi/Maxi prep - 박테리아(대장균)의 cell wall과 cell membrane을 깨뜨려 크기가 큰 chromosomal DNA를 제외한 작은 크기의 plasmid DNA를 분리하는 것.

서론 (DNA Extraction) Bacterial DNA (chromosomal DNA) Plasmid DNA - linear한 double helix 형태 (두 가닥이 꼬여진 이중나선) - pH에 따라 single stand DNA로 변성되며 중화할 경우 복원되기 힘들다. Plasmid DNA 세포 내 염색체 외에 존재하는 DNA로, 독자적으로 복제됨. 세균의 생존에 필수적이진 않으며, 한 세포에서 다른 세포로 이동 가능함. (이 성질을 이용하여 유전공학에서 유전자 재조합 및 복제 등에 이용.) - 고리모양의 supercoiled 형태 (한 가닥이 꽈배기모양으로 꼬여진 형태) - pH에 따라 변성되며 중화할 경우 원래 형태로의 복원이 용이하다.

서론 (DNA Extraction) Mini Prep pH에 따라 double helix 형태와 supercoiled 형태가 변성되는 것이 다른 원리를 이용하여 순수한 plasmid DNA를 정제할 수 있다. Double helix DNA가 denature(변성)되어 single strand DNA로 Supercoiled DNA인 plamid는 상태 유지

서론 (Restriction enzyme) 1960년대 후반에 발견. Bacteria가 bacteriophage의 공격을 받았을 때, 외부에서 들어온 DNA 만 절단하는 효소에서 유래. 현재 200여종 이상의 제한효소가 발견됨.

서론 (Restriction enzyme) Plasmid vector map (pSG5)

서론 (Restriction enzyme) - Mode of action

서론 (Restriction enzyme) 제한효소의 응용

재료 및 방법 (Materials & Methods) - Plasmid DNA isolation Mini prep Kit bacterial pellet(세포침전물) 원심분리기 파이펫, 팁, EP tube 장갑 제한효소 (EcoRI, DW, buffer)

재료 및 방법 (Materials & Methods) Bacteria culture를 13,000 rpm (≒10,000 xg) 로 1분간 원심분리하여 pellet를 만들어 상층액은 버린다. 2. PD1 buffer(cell resuspension solution)를 EP tube에 담겨진 pellet에 200 ul 넣어 파이펫을 이용하여 조심히 섞는다. => 세포 풀어주는 역할 3. PD2 bufffer(cell lysis solution)를 200 ul 넣어 10회 inverting 한 후, 상온에서 2분간 둔다. => 세포막을 파괴하고 DNA를 변성시키는 역할 (강염기성용액)

재료 및 방법 (Materials & Methods) 4. PD3 buffer(neutralization solution)를 300 ul 넣고 즉시 10회 inverting 한다. => 변성된 DNA를 중화하는 역할 (산성용액), Plasmid DNA만 복원됨. 변성된 다른 DNA는 하얗게 엉기게 된다. 5. 13,000 rpm (≒10,000 xg) 로 1분간 원심분리한다. 6. 상층액(약 650 ul)을 파이펫을 이용하여 column(+ collection tube)에 옮긴 후 13,000 rpm 로 1분 동안 원심분리한다. => 하얗게 엉긴 물질이 같이 따라오지 않도록 맑은 용액 (Plasmid DNA)만 뽑아낸다.

재료 및 방법 (Materials & Methods) 7. collection tube에 나온 하층액을 버린 후 column을 collection tube에 꽂는다. 8. Wash Buffer(WB) (column wash solution)를 600ul 넣고 1분간 원심분리 후 하층액을 버리고 다시 collection tube를 꽂는다.  Guanidinium Chloride (guanidine hydrochloride):남아있는 protein denature 10. 남아있는 wash buffer를 제거하기 위해 빈 column 을 2분간 원심분리 후 column을 새로운 EP tube에 옮긴다. ★☆ 뒤에 elution과정에서 column에 붙어있는 plasmid DNA들이 밑으로 내려오게 되므로 꼭!!! 새 tube로 옮겨줄 것!!!

재료 및 방법 (Materials & Methods) 11. Elution Buffer(EL) 를 30 ul 넣은 후 3분간 세워놓은 후 다시 1분간 원심분리한다. => column의 정 가운데 부분에 buffer를 넣어야 elution이 효율적으로 일어난다!! ---------------------- plasmid DNA isolation 끝 -------------------------- 12. 11번까지 실행한 DNA 10 ul와 EcoR I 1 ul와 buffer 4 ul와 D.W 5 ul를 새로운 EP tube에 넣어 5회 inverting 한다. DNA isolation 끝난 조 앞으로 sample 가져오시면 조교가 넣어 드립니다. 13. 12번까지 완료한 sample을 37도 에서 2시간 반응시킨다. ※ Elution까지 다 끝난 조는 Sample 제한효소 자를거(10ul), 안 자를거(20ul) 총 2개씩 제출하기~

재료 및 방법 (Materials & Methods) 제한효소 반응 11. 10에서 얻은 DNA 10 ul 제한효소 (EcoRI) 1 ul 10X EZ-One™ buffer 4 ul D.W 5 ul ------------------- Total volume 20ul 를 새로운 EP tube에 넣고 5회 inverting. 12. 11번의 sample을 37도에서 2시간 반응시킨다. 13. 냉동고 (-20℃)에 보관한다.

결과(Result) 결과 (Result) 1. 다음 실험 수업에 DNA 젤 전기영동을 통하여 mini prep한 plasmid DNA가 제한효소로 절단된 결과를 확인한다.