분자생물학실험 SUBJECT Electrophoresis 결과 확인, Sequence blast 2014-10-15

분자생물학실험 DNA EXTRACTION PCR TA Ligation E.coli transformation Mini-prep Sequence blast Restriction enzyme Mini-prep E.coli transformation TA Ligation PCR DNA EXTRACTION

분자생물학실험 수업시간에 배웠던 restriction enzyme site 찾는 법을 사용하여 size예측 Materials & Method 수업시간에 배웠던 restriction enzyme site 찾는 법을 사용하여 size예측 294bp 295bp 294bp 295bp 614 614 334 334 1755 1755 Gene1: 1596bp Vector: 3807bp Nco1- insert : cut at 614bp - vector: cut at 1755bp Xho1 - vector : cut at 334bp Insert의 방향이 정방향 Band size: 1021bp / 1421bp / 2961bp Insert의 방향이 역방향 Band size: 653bp / 1421bp / 3329bp

분자생물학실험 수업시간에 배웠던 restriction enzyme site 찾는 법을 사용하여 size예측 Result & Discussion 수업시간에 배웠던 restriction enzyme site 찾는 법을 사용하여 size예측 294bp 295bp 294bp 295bp 1276 1276 346 346 Gene2: 2076bp Vector: 3807bp Xba1- insert: cut at 1267bp - vector: cut at 346bp Insert의 방향이 정방향 Band size: 860bp / 5023bp Insert의 방향이 역방향 Band size: 1318bp / 4565bp

분자생물학실험 Materials & Method Agarose gel loading - DNA loading dye : 1㎕ - template : 3㎕ - DNA ladder : 3 ㎕ 1 2 Ladder 3 4 Plasmid Gene1 (Nco1 +Xho1) Gene2 (Xba1)

분자생물학실험 Materials & Method Gene1 Gene2 3.0Kb → 1.0Kb → → Gene1 & Gene2 Plasmid DNA Sequencing

분자생물학실험 Sequencing

분자생물학실험 Materials & Method 294 295 M13 Forward M13 Reverse

분자생물학실험 Materials & Method

분자생물학실험 Materials & Method

분자생물학실험 Materials & Method

분자생물학실험 Materials & Method BLAST에 이용!

Sequencing 결과 비교 http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi Materials & Method

M-13F 또는 M-13R-pUC 시퀀스 입력 Gene 시퀀스 입력

* Gene 시퀀스, M13F 비교결과

* Gene 시퀀스, M13R-pUC 비교결과

분자생물학실험 Materials & Method Sequence Blast http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome

분자생물학실험 Materials & Method ① sequence 입력 (file 불러오기도 가능) ① ② BLAST click ③ (option – new window) ② ③

분자생물학실험 Result & Discussion Restriction enzyme 확인 band 사진 각각의 band마다(Enzyme 이름/ 방향/ size 기재) 예상과 다른 결과가 나왔다면, 그 원인에 대해 작성할 것 M13 Forward와 M13 Reverse primer를 이용하여 sequencing 한 Gene1, Gene2 각각의 sequencing 결과(peak-pdf file) 붙이고, sequencing 결과(염기서열 text file)에서 TA vector와 Gene1/Gene2의 위치를 표시(vector map 참고) Sequencing을 할 때, PCR 단계에서 insert를 증폭할 때 사용한 primer가 아닌 M13 primer를 사용한 이유 M13Forward primer 와 Reverse primer를 둘 다 사용한 이유 (힌트 : 뒷부분일수록 염기서열이 일치한다고 표시되는 막대가 줄어든다. Peak pdf 파일과 연관지어 설명할 것) M13 Forward primer이용한 염기서열 결과에서 vector와 insert의 염기서열이 vector map과 gene의 염기서열과 다르며, blast를 하였을 때 nucleotide 순서 번호가 역행한 이유 M13 Forward primer이용하여 발견된 insert 염기서열 부분과 M13 Reverse primer를 이용하여 발견된 insert 염기서열 결과의 부분이 다른 이유

분자생물학실험 Result & Discussion Sequencing 결과를 NCBI에서 BLAST 한 후 (sequence 비교 결과 붙이기) 각각 유전자가 애기장대에서 무엇인지 알아오기 (Gene 이름, AT number.) 참고 web site : http://www.arabidopsis.org/

Plasmid DNA loading

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