PCR (Polymerase Chain Reaction) Ⅰ

01 실험 목적 PCR PCR의 이론을 이해하고 실험 통해 과정을 단계별로 숙지하여 본다.

02 Introduction PCR (Polymerase Chain Reaction) 계대배양 02 Introduction PCR (Polymerase Chain Reaction) 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 

계대배양 02 Introduction PCR 과정 cycling

02 Introduction Step 1 : Denaturation 두 가닥의 DNA를 약 94℃에서 15~30초간 처리 계대배양 02 Introduction Step 1 : Denaturation 두 가닥의 DNA를 약 94℃에서 15~30초간 처리 Double strand DNA → Single strand DNA

02 Introduction Step 2 : Annealing 계대배양 02 Introduction Step 2 : Annealing 약 50~65 ℃ 정도로 온도를 떨어뜨려 분리된 ssDNA에 상보적인 sequence를 갖는 primer가 결합 Primer의 Tm 값에 의해 온도결정 3’ 5’ Forward primer Sense strand Antisense strand Reverse primer

02 Introduction Step 2 : Annealing 계대배양 02 Introduction Step 2 : Annealing Primer 제작 좋은 Primer 조건 20~25mer Primer 간의 상보성 X GC 함량 너무 높지 X 두 primer의 Tm값이 비슷 Temperature of melting (Tm 값) *Tm 값 = {4(G+C)} + {2(A+T)} ℃ 5’-ATGGCGGAGGCTGCAACTCCCGGAAAAATT-3’ 3’-TTTTAA-5’ 5’-ATGGCG-3’ 3’-TACCGCCTCCGACGTTGAGGGCCTTTTTTAA-5’

Tm 온도가 너무 높을 때 -primer가 tamplate에 붙지 않음 Tm 온도가 너무 낮을 때 -non-specific binding ↑ Tm 온도가 맞을 때 -specific binding

02 Introduction Step 3 : Extension 계대배양 02 Introduction Step 3 : Extension Taq DNA polymerase의 최적 활성온도인 약 68~72 ℃ 에서 진행 *호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 유래하는 내열성 DNA중합효소 Annealing 단계에서 결합된 primer의 3’-OH에서부터 dNTP를 하나씩 첨가하여 extension 3’ 5’ Forward primer Sense strand Antisense strand Reverse primer Taq

1회cycle에서 합성된DNA는 다음cycle에서는 PCR반응의 기질로 이용 계대배양 02 Introduction Cycle 1회cycle에서 합성된DNA는 다음cycle에서는 PCR반응의 기질로 이용

02 Introduction PCR 종류 ● RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) 계대배양 02 Introduction PCR 종류  ● RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) - Revers transcriptase (역전사 효소)를 이용하여 RNA 로부터 cDNA를 합성한 후 PCR을 하는 방법 ● qRT-PCR (Quantitative Real Time-PCR) - PCR 과정중 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 수치화하여 샘플에 존재하는 기질의 초기량을 정확히 정량화 할 수 있음

02 Introduction Gel electrophoresis -PCR을 통해 증폭된 DNA product를 확인하는 방법 계대배양 02 Introduction Gel electrophoresis -PCR을 통해 증폭된 DNA product를 확인하는 방법 

계대배양 03 Materials & Methods 다음 표를 참고하여 PCR solution을 만든다. Tapping으로 섞어준 후 spin-down. PCR machine에 온도 시간 설정 후 작동시킨다. PCR product 만들기 : DDW, PCR master Mix, DNA template, Primer, Pipette, Tip, PCR machine Master Mix 15µl DNA template 2µl Primer (Forward) 1µl Primer (Reverse) DDW 11µl total 30µl

계대배양 03 Materials & Methods Agarose powder 0.4g와 TAE buffer 20ml을 비커에 넣고 살짝 흔들어준다. 2. 비커에 랩을 씌우고 구멍을 살짝 뚫은 채 전자레인지에서 1분간 돌려준다. 3. powder가 완전히 녹으면 gel stain 1µl를 넣고 잘 흔들어 준다. 4. Gel tray에 완전히 녹은 gel 용액을 붓고 comb을 끼워준다. Agarose powder, TAE buffer, 전자레인지, 랩, 저울, 기름종이, 시약 숟가락, 비커, gel tray, comb, gel stain, Pipette, Tip

계대배양 04 Result

계대배양 05 Discussion 4주차 + 5주차 report ->4월 6일 수업 시작 전에 제출