18장 시트르산 회로 II 18장 회로로부터 전자들의 수확 시트르산 회로는 두 단계로 이루어진다: 첫 번째 단계는 2탄소 분자를 산화시키고 두 번째 단계는 oxaloacetate 을 재생하고 높은 에너지의 전자들을 수확한다   시트르산 회로의 시작과 회로를 통한 대사는 조절된다   glyoxalate 회로는 식물과 박테리아가 지방을 탄수화물로 전환할 수 있도록 한다 18장 회로로부터 전자들의 수확

1. 시트르산 회로는 두 단계로 구성   시트르산 회로의 기능은 탄소 연료로부터 ATP 합성의 동력으로 사용될 높은 에너지 전자(high-energy electrons)를 수확하는 것 1단계: 2탄소 원자가 4탄소 분자인 oxaloacetate과 결합함으로써 회 로로 진입하고 6탄소 화합물은 CO2를 2번 방출하고 높은 에너지 전자를 생성 2단계: 남아 있는 4탄소 화합물은 산화되어 oxaloacetate로 재생되 고 연속적으로 회로를 진행

시트르산 회로 자체는 많은 ATP를 발생시키지 않고 산소를 반응물로 포함하지도 않음 시트르산 회로는 acetyl CoA로부터 전자들을 제거하여 NADH와 FADH2를 생성 전자운반체들은 산화적 인산화 반응에서 O2에 의하여 산화되면 9분자의 ATP를 생성 NADH와 FADH2가 재산화되면서 방출된 전자들은 일련의 막 단백질[전자전달 사슬(electron-transport chain)이라고도 함]을 통하여 흐르면서 막을 가로질러 양성자 기울기를 형성하여 무기인산과 ADP로부터 ATP를 생성

2. 첫 번째 단계는 2탄소 분자를 산화시킴 citrate synthase가 oxaloacetate과 acetyl CoA로부터 citrate을 형성 시트르산 회로는 4탄소 분자인 oxaloacetate과 2탄소 분자인 acetyl CoA의 아세틸기의 축합으로 시작 oxaloacetate은 acetyl CoA와 H2O와 반응하여 citrate과 CoA를 생성 oxaloacetate은 acetyl CoA와 축합하여 citryl CoA를 생성 citryl CoA는 acetyl CoA로부터 유래한 thioester 결합을 포함하고 있기 때문에 풍부한 에너지를 가짐 citryl CoA thioester가 citrate과 CoA로 가수분해되는 것이 전체 반응을 citrate 합성 쪽으로 유도

citrate synthase의 작용 메커니즘 Acetyl CoA의 가수분해와 같은 원하지 않는 반응을 방지 citrate synthase (시트르산 합성효소)는 oxaloacetate과 결합하고 그 다음에 acetyl CoA와 결합 기질들이 순차적으로 결합하는 이유는 oxaloacetate이 효소의 중요한 구조적 재배열을 유도하여 acetyl CoA가 결합할 수 있는 결합 부위를 만들어줌 oxaloacetate이 결합하면 효소의 열린 형태가 닫힌 형태로 바뀜 이런 구조적 변화는 acetyl CoA가 결합할 수 있는 부위를 만듬

citrate synthase는 oxaloacetate과 acetyl CoA를 축합하여 citryl CoA를 형성하도록 촉매 그 다음에 효소는 citryl CoA의 thioester를 가수분해 먼저 CoA가 효소를 떠나고, 그 다음에 citrate이 떠나면, 효소는 초기의 열린 구조로 다시 돌아옴 citrate synthase는 citryl CoA를 잘 가수분해할 수 있지만 acetyl CoA는 그렇지 못함 : acetyl CoA는 oxaloacetate이 효소에 결합하고 축합 준비가 될 때까지 효소에 결합하지 못함 thioester 연결을 가수분해하는 데 중요한 촉매성 잔기들이 citryl CoA가 형성될 때까지 적절한 곳에 위치하지 못함, 유도된 적합(induced fit)은 원하지 않는 측면반응이 일어나는 것을 방지

새로 생성된 citrate 분자는 산화 반응에 필요한 적절한 구조를 이루지 않음 2) citrate의 isocitrate(이소시트르산)으로 이성질화 새로 생성된 citrate 분자는 산화 반응에 필요한 적절한 구조를 이루지 않음 6탄소 분자가 산화적 탈카르복실화를 거칠 수 있도록 citrate가 isocitrate로 이성질화되어야 함 citrate의 이성질화는 물 분자 제거 단계와 뒤이은 물 분자 첨가 단계로 구성 → 그 결과 H와 OH의 위치가 바뀜 이 반응을 촉매하는 효소는 aconitase(아코니트산 수화효소)임 Aconitase 저해제(제충제)

3) Isocitrate는 산화되고 탈카르복실화되어 α-ketoglutarate가 된다 시트르산 회로의 4번의 산화-환원 반응들 중 첫 번째 산화반응 Isocitrate가 α-ketoglutarate로 되는 산화적 탈카르복실화 반응은 isocitrate dehydrogenase (이소시트르산 탈수소효소)가 촉매 α-케토산인 oxalosuccinate는 효소에 결합되어 있는 동안 CO2를 잃고 α-ketoglutarate을 생성 이 산화반응은 첫 번째로 높은 이동-전위-전자 수용체인 NADH를 생성

α-ketoglutarate의 두번째 산화적 탈카르복실화에 의하여 succinyl CoA 생성 Pyruvate dehydrogenase 복합체와 구조적으로 유사하면서 3종류의 효소들이 결합되어 있는 α-ketoglutarate dehydrogenase (α-케토글루타르산 탈수소효소) 복합체가 촉매 α-ketoglutarate의 산화적 탈카르복실화는 α-케토산인 pyruvate의 반응과 비슷 두 반응은 모두 α-케토산의 탈카르복실화를 포함하며 CoA에 높은 이동-퍼텐셜을 갖는 thioester 연결을 형성 시트르산 회로의 이 지점에서 2개의 탄소 원자가 회로로 들어오고 2개의 탄소 원자가 CO2로 산화 산화로부터 생성된 전자들은 NADH에 전달됨

3. 두 번째 단계는 oxaloacetate을 재생하고 높은 에너지 전자들을 수확 시트르산 회로의 두 번째 부분은 회로의 출발 물질인 oxaloacetate를 재생하고 재생 과정은 높은 이동-퍼텐셜 전자들의 수확과 GTP 혹은 ATP와 같은 높은 인산기-이동 퍼텐셜 화합물을 생성 1) 높은 인산기-이동 퍼텐셜을 가진 화합물이 succinyl CoA로부터 생성 α-ketoglutarate dehydrogenase에 의하여 생성된 succinyl CoA는 에너지가 풍부한 thioester 화합물임 (ΔG°´ = -33.5 kJ/mol) succinyl CoA의 thioester 결합의 분해는 ADP (근육과 심장) 혹은 GDP(간)와 같은 purine nucleoside diphosphate의 인산화와 연결됨 이 반응은 succinyl CoA synthetase (석시닐 CoA 합성효소)가 촉매 이 반응은 높은 인산기-이동 퍼텐셜을 가진 화합물을 생성하는 시트르산 회로의 유일한 과정

succinyl CoA synthetase 작용 thioester 분자 고유의 에너지가 인산기-이동 퍼텐셜로 이동 : succinyl CoA의 CoA가 orthophosphate으로 교체 → 새로운 높은 에너지 화합물인 succinyl phosphate(석시닐 인산)을 생성 → 효소의 His 잔기가 움직이는 팔로 작용하여 succinyl phosphate으로부터 인산기를 떼어내어 효소에 결합되어 있는 nucleoside diphosphate에게 인산기를 회전하여 전달 → nucleoside triphosphate을 생성 반응의 모든 단계에 높은 에너지 화합물이 참여한다는 것은 반응이 쉽게 가역적이라는 사실로 알 수 있음 : ΔG°´ = -3.4 kJ mol-1 (-0.8 kcal mol-1)

2) oxaloacetate은 succinate의 산화에 의하여 재생된다 Succinate는 차례로 산화되어 oxaloacetate을 재생 CH2는 산화, 수화와 이어지는 산화의 3단계를 거쳐 카르보닐기(C = O)로 전환 oxaloacetate이 새로운 회로를 위하여 재생되고 FADH2와 NADH 형태로 더 많은 에너지가 추출됨

첫 번째 과정은 succinate dehydrogenase에 의하여 succinate이 fumarate으로 산화됨 첫 번째 과정은 succinate dehydrogenase에 의하여 succinate이 fumarate으로 산화됨. 이 때 수소 수용체는 NAD+가 아니라 FAD임 FAD가 수소 수용체로 사용되는 이유는 자유에너지의 변화가 NAD+를 환원하기에는 불충분하기 때문 succinate dehydrogenase는 미토콘드리아 내막에 박혀 있음 → 효소가 미토콘드리아 내막에서 수행되고 있는 전자전달 사슬과 직접적으로 연결 가능 → 전자전달 사슬은 시트르산 회로와 ATP 합성을 연결 succinate의 산화에 의하여 생성된 FADH2는 다른 산화-환원 반응에서 생성된 NADH와 대조적으로 효소로부터 분리되지 않음 succinate dehydrogenase는 FADH2의 두 개의 전자들을 보조효소 Q (CoQ)에 직접 전달 전자전달 사슬의 중요한 구성성분인 CoQ는 전자들을 최종 수용체로 전달

succinate이 fumarate으로 산화된 후 fumarase(푸마르산 수화효소)의 촉매 작용으로 fumarate이 수화되어 l-malate(l-말산)이 생성 마지막으로, malate은 oxaloacetate으로 산화됨. 이 반응은 malate dehydrogenase(말산 탈수소효소)에 의하여 촉매되고 NAD+가 수소 수용체로 이용됨 malate + NAD+ → oxaloacetate + NADH + H+ 이 반응의 표준자유에너지는 시트르산 회로의 다른 과정들과 다르게 수월하지 않다 (ΔG°´ = +29.7 kJ mol-1, +7.1 kcal mol-1) malate의 산화는 citrate synthase에 의한 oxaloacetate의 사용과 전자전달 사슬에 의한 NADH의 사용에 의하여 추진됨

시트르산 반응 요약 시트르산 회로는 높은 이동-퍼텐셜 전자들과 nucleoside triphosphate, CO2를 생성 시트르산 회로의 전체반응 : acetyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP(ADP) + Pi + 2 H2O →  2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP(ATP) + 2 H+ + CoA  

oxaloacetate과 acetyl 단위가 축합하면서 2탄소 원자가 회로로 들어감 oxaloacetate과 acetyl 단위가 축합하면서 2탄소 원자가 회로로 들어감. 2탄소 원자는 연속적인 탈카르복실화에 의하여 CO2를 형성하여 회로를 떠남 네 쌍의 수소원자들이 네 번의 산화반응으로 회로를 떠남, 두 분자의 NAD+가 isocitrate과 α-ketoglutarate의 산화적 탈카르복실화 반응에서 환원되고, FAD 분자는 succinate의 산화로 환원되며, 한 분자의 NAD+는 malate의 산화에 의하여 환원됨. 한 분자의 NAD+가 pyruvate에서 acetyl CoA를 형성하는 산화적 탈카르복실화 과정에서 환원됨 높은 인산기 이동 퍼텐셜을 가진 화합물이 succinyl CoA의 thioester 결합의 분해로부터 생성됨 두 분자의 물이 소비됨. 한 분자는 citryl CoA의 가수분해에 의한 시트르산의 합성에서, 다른 분자는 fumarate의 수화에서 사용됨

동위원소 표지법 실험에 의하면 회로로 들어간 2개의 탄소가 회로를 떠나는 것은 아니고 아세틸기 형태로 회로로 들어간 2개의 탄소는 처음 두 번의 탈카르복실화 반응 동안 보존되어서 회로의 4탄소 산에 결합하여 남음 succinate은 대칭을 이루는 분자 → 회로로 들어온 두 개의 탄소 원자는 4탄소 산의 이어지는 대사에서 어느 탄소 자리든지 위치할 수 있음 시트르산 회로의 효소들이 물리적으로 서로 연결되어 있어 [대사단위체(metabolon)] 반응 생성물이 기질 통로(substrate channeling)라고 불리는 연결 통로를 통하여 한 활성 부위로부터 옆에 위치한 활성부위로 직접 전달 → 효소의 밀접한 배열은 시트르산 회로의 효율을 높임

에너지 생성 전자전달 사슬은 시트르산 회로에서 생성된 NADH와 FADH2를 산화 이들 운반체로부터 최종 전자 수용체인 O2로 전자의 전달은 미토콘드리아 내막을 가로질러 양성자 기울기를 생성 → ATP를 생성하는 힘 한 분자의 NADH로부터 약 2.5 ATP, 한 분자의 FADH2로부터 약 1.5 ATP가 생성됨 결론적으로, 3개의 NADH 분자와 한 개의 FADH2 분자가 전자전달 사슬을 통하여 산화되면 9개의 높은 이동-퍼텐셜 인산기가 생성되며, 시트르산 회로가 한 번 돌 때마다 한 개의 높은 이동-퍼텐셜 인산기가 직접적으로 생성됨 → 즉 한 개의 아세틸 분자는 약 10분자의 ATP를 생성 해당과정은 호기성과 혐기성 상태에서 모두 일어날 수 있지만 시트르산 회로에서는 호기성 상태에서만 작동

4. 시트르산 회로의 조절 1) 회로의 중요한 조절 지점 : 다른자리 입체성 효소인 isocitrate dehydrogenase α-ketoglutarate dehydrogenase  촉진: ADP와 pyruvate 억제: ATP와 NADH isocitrate dehydrogenase 와 α-ketoglutarate dehydrogenase 를 조절 지점으로 이용하면 다른 대사경로들과 함께 통합 조절하는 중심에 위치하게 함: 세포 내 조건에서는 isocitrate과 citrate의 전환이 가역적으로 쉽게 이루어지기 때문에 isocitrate dehydrogenase의 억제는 시트르산의 축적을 유도 → 시트르산은 세포질로 운반될 수 있으며 PFK에 해당과정을 억제하고 지방산 합성을 위한 아세틸 CoA의 공급원으로 이용 α-ketoglutarate dehydrogenase가 억제되었을 때 축적되는 α-ketoglutarate은 몇몇 아미노산과 퓨린 염기의 전구체로 사용됨

2) 시트르산 회로는 생화학적 전구물질들의 공급원 헤모글로빈과 미오글로빈에 있는 heme 그룹의 전구물질인 porphyrin에 있는 대부분의 탄소 원자들은 succinyl CoA로부터 유래 많은 아미노산과 염기가 α-ketoglutarate과 oxaloacetate으로부터 유래

3) 시트르산 회로는 신속하게 보충되어야 함 시트르산 회로는 생물학적 에너지의 생성과 생합성 반응을 구성하는 물질들의 공급원으로 중요 이중 사용의 문제 : 많은 oxaloacetate이 glucose로 전환되고, 그 결과로 세포의 에너지 필요량이 높아짐 → acetyl CoA는 oxaloacetate과 축합 없이는 시트르산 회로로 들어갈 수 없기 때문에 새로운 oxaloacetate이 생성될 때까지 시트르산 회로는 감소 → 비록 oxaloacetate이 재생되기는 하지만, 회로가 기능을 하려면 최소한의 양이 유지되어야 함. 일부 생합성을 포기하더라도 시트르산 회로의 중간물질들이 보충되어야 함 oxaloacetate 은 biotin 의존성 효소인 pyruvate carboxylase(피루브산 카르복실화효소)의 반응에 의하여 pyruvate의 카르복실화로 생성됨 pyruvate + CO2 + ATP + H2O → oxaloacetate + ADP +Pi + 2 H+

pyruvate carboxylase는 acetyl CoA가 있을 때만 활성화되며, 더 많은 oxaloacetate이 필요하다는 신호로 작용 에너지 수준이 높으면 oxaloacetate 은 glucose로 전환되고 에너지 수준이 낮으면 oxaloacetate 이 시트르산 회로로 보충됨 pyruvate의 카르복실화에 의하여 oxaloacetate가 합성되는 것은 보충반응(anaplerotic reaction)의 한 예 시트르산 회로는 순환하기 때문에 어떤 중간산물들도 생성에 의하여 보충 가능 : ex) glutamate과 aspartate에서 질소가 제거되면 각각 α-ketoglutarate과 oxaloacetate 이 생성됨

임상적 통찰 시트르산 회로의 결함은 암 유발 succinate dehydrogenase (석신산 탈수소효소), fumarase(푸마르산 수화효소), pyruvate dehydrogenase kinase (피부르산 탈수소화 키나제)의 돌연변이가 일어나면 succinate과 fumarate이 세포질에 누적되어 HIF-1를 수산화 반응시키는 prolyl hydroxylase 2 (프롤린 수산화효소2)를 저해 → HIF-1에 수산화기가 첨가 되지 않아 가수분해되지 않아 포도당 대사 관련 단백질들의 농도가 높아져 해당작용 촉진 따라서 암세포에서 시트르산 회로를 활성화시킨다면 암세포 성장 억제 가능성 시사

Oxygen-dependent regulation of HIF-1 stabilization and transactivation In normoxia (left), two proline residues of HIF-1 and asparagine are hydroxylated by PHDs and FIH-1, respectively, in an O2, 2-OG, and Fe2+-dependent manner. Hydroxylated HIF-1 proteins bind to the E3 ubiquitin ligase VHL complex, leading to its degradation by the proteasome. Hydroxylated N803 blocks the recruitment of transcriptional coactivator CBP/p300. In hypoxia (right), the activities of PHDs and FIH-1 are inhibited due to lack of O2, resulted in no proline and asparagine hydroxylation. Therefore, there is no VHL binding and HIF-1 is stabilized. Stabilized HIF-1α proteins translocate to the nucleus and bind to HIF-1β. HIF-1 may bind preferentially to the MAPK-induced phosphorylated form of HIF-1. Nonhydroxylated N803 of HIF-1 allows CBP/p300 recruitment to the target genes, resulting in gene transcription.

5. Glyoxylate (글리옥실산) 회로는 식물과 박테리아가 지방을 탄수화물로 전환할 수 있도록 한다 glucose 생성의 중요한 전구물질인 oxaloacetate이 시트르산 회로에서 생성되지만 oxaloacetate 이 재생되기 전에 2번의 탈카르복실화 반응이 먼저 일어남 → acetyl CoA가 glucose로 전환되는 것은 불가능 식물과 일부 박테리아는 저장된 지방으로부터 생성된 acetyl CoA를 glucose로 전환할 수 있는 glyoxylate 회로를 가짐 반응들은 시트르산 회로와 유사하지만, 시트르산 회로의 2번의 탈카르복실화를 우회함 glyoxylate 회로는 한 바퀴 도는 동안 2분자의 acetyl CoA가 들어가지만 시트르산 회로는 한 분자의 acetyl CoA가 들어간다는 것이다

글리옥실산 회로 글리옥실산 회로는 시트르산 회로처럼 acetyl CoA와 oxaloacetate이 축합하여 citrate을 생성하면서 시작하고, 그 다음에 isocitrate으로 이성질화됨 시트르산 회로에서는 탈카르복실화가 일어나지만, 글리옥실산 회로에서는 isocitrate lyase(이소시트르산 분해효소)에 의하여 succinate과 glyoxylate으로 나뉨 malate synthase(말산 합성효소)가 촉매하는 반응으로 acetyl CoA가 glyoxylate과 축합하여 malate을 형성함 시트르산 회로에서와 같이, malate이 oxaloacetate으로 산화 2 acetyl CoA + NAD+ + 2 H2O → succinate + 2 CoASH + NADH + 2 H+

식물에서, 이 반응은 글리옥시솜(glyoxysome)이라고 불리는 세포소기관에서 일어남 회로의 중간에서 생성된 succinate은 시트르산 회로와 glucose 신생합성을 통하여 탄수화물로 전환 가능 이 경로로 얻는 탄수화물은 씨앗이 발아하고 성장하여 광합성을 하기 전까지 에너지원으로 중요 글리옥실산 회로를 갖는 개체들은 acetyl CoA를 glucose와 다른 생체 분자의 전구물질로 이용할 수 있기 때문에 대사의 다양성 확보 가능