유전자 구조와 발현의 조절 대부분의 생명체는 아주 조금, 조금의 단백질만을 생산한다 DNA에 의해 만들어질 수 있는 많은 경우의 수보다도 휠씬 적은 단백질을 만들고 있다. 즉 수많은 필요이상의 DNA를 가지고 있다 (예외: viral genes – overlapping usage of DNA).

Plasmid: an extrachromosomal genetic element found in a variety of bacterial species. (Double strand, CCC ranging in size from 1~200kb. Independent replication ori.) - Useful to gene transfer (transformation, conjugation) as a vector - Replication type: stringent, relaxed type. - plamid incompatibility    Transposon (transfosable elements): a class of DNA sequences that can move from one chromosomal site to another. (transposase and resolvase) see figure. l     Structural gene: the minimum length of DNA (or RNA), which can specify the complete amino acid sequence of a protein.   cistron: the section of the DNA molecules that specifies the formation of a particular polypeptide chain    

operon: a unit consisting of adjacent cistrons that function coordinately under the control of an operator gene (operator + promoter + structural gene 으로 구성)     operator: a chromosomal region capable of interacting with a specific repressor, thereby controlling the functioning of adjacent cistrons     promoter: a region on a DNA molecule to which an RNA polymerase binds and initiates transcription (하나의 operon에서 promoter는 보통 operator 뒤쪽에 인접하여 존재하며, promoter의 염기배열이 효소결합 능력과 RNA생산 속도를 결정한다) (cis acting)    regulator: a gene whose primary function is to control the rate of synthesis of the products of other distant genes (cis-tran acting molecules) (대표적으로 regulator gene은 operator의 역할을 방해하는 repressor의 합성을 조절한다)       regulon: a noncontiguous group of genes under control of the same regulator gene

유전자의 구조 원핵세포의 경우 DNA로 구성된 chromosome과 plasmid가 구조 유전자를 가지며, independent genes, transcription units, operons으로 대별 independent genes: 유전자의 발현이 항상 독립적으로 일어나며, 전사조정이 없는 경우 대부분 mono-cistronic, non-interrupted genes spacer DNA: 유전자와 유전자 사이에 존재하는 DNA Transcription units: 관련된 기능을 가진 유전자들의 동시 발현 유전자 그룹 대부분이 polycistronic (mRNA, rRNA 등)

진핵세포의 경우 independent genes, repeated genes, gene cluster로 구별, mRNA의 경우 특히 monocistronic과 intron의 특징을 가짐. Independent gene: 독자적으로 발현되나, 외부인자 (예, 호르몬)에 의해 발현조절 가능 Repeated gene: single gene repeat (ex, 5S rDNA) Gene cluster: 관련기능을 하는 유전자의 cluster Satellite DNA: 10~200 nucleotide의 비전사 DNA Intron : transcribed but non-translated DNA region (1차 전사후 splicing에 의해 제거) Splicing site (5’ GA ~ 3’ AG) 진핵세포의 바이러스 경우: overlapping and discontinuous genes (introns and overlapping in SV40).

대사는 조절되어야 한다.

대사조절의 다양한 방식 1. 유전자 수, 위치에 의한 조절 : gene dosage, gene cluster, 유전자 위치 poly-cistronic (Z,Y,A in lac operon), repeated genes 2. 효소활성의 양적조절 : Induction, repression (feedback, catabolite), ribosome 수의 조절 3. 효소활성의 질적조절 : inhibition, activation : 전구체, zymogen에 의한 시간적 조절 : 공간적 격리에 의한 조절 (lysosome, mitochondria) : covalent modification – phosphorylation, tyrosination : allosteric regulation – allosteric effector : 호르몬, 또는 signal에 의한 원격조절- 호르몬들, cAMP, other secondary messengers, : 세포막 투과에 의한 조절 (passive or active: 가변) : 에너지 charge에 의한 조절 EC = [ATP] + 1/2 [ADP] / [ATP]+[ADP]+[AMP] limit is 0.85

유전자 발현의 조절 유전자 발현의 조정은 왜 필요한가??? 1. 특정물질은 특정시기에 필요하므로, 필요에 따라 생산량이 조절되어야 한다 (효율적 발현) 2. 만들어진 효소는 에너지나 특정물질을 계속 소모시키므로 합성과 활성이 조절되어야 한다. 3. 단위시간당 최대의 에너지를 생산하도록 여러 시스템간의 조절이 필요하다. 4. 잘못 생산된 물질(defective molecules)의 경우 생산시스템을 저해 내지 중지시켜야 한다.

6 possible-pathway

원핵세포의 일반적인 대사조절 기작 1.  필요하면 만들고, 필요하지 않으면 만들지 않는다 (on-off control in transcription and/or translation system) 2. 생명체에서 off는 very low의 의미이다. 3. 전사,번역조절 (합성의 조절): coordinate regulation (polycistronic mRNA) 4. 전사조절은 positive, negative 모두 가능하다 5. 활성의 조절: feedback inhibition (end-product inhibition)

원핵세포의 전사조절 : DNA-binding protein, attenuation, exchange of the sigma factor 대표적인 조절 시스템 : Lac operon (Jacob and Monad) and Trp operon

Lac 예비실험들 1. Lac- mutant 와 F’ lac (F prime)의 조제 2. 이들로부터 partial diploid 생산 가능 (F’ Lac- / Lac +, or F’ Lac+/ Lac-) 3. partial diploid는 lactose utilize (즉, lac mutant는 inhibitor를 만드는 것은 아니다) 4. 다양한 돌연변이의 complementationt 실험에서 lac Y, Z, A, lac O, lac P, lac I 확인 5. F’ y-z+/y+z-, F’y+z-/y-z+: lac+ phenotype F’ y-z+/y-z+, F’y+z-/y+z-: lac – phenotype 6. lactose 처리 후 lactose uptake 확인 (C14, Lactose) y- z+: No, y+z- : Yes  y; permease, z; beta-galactosidase 7. genetic mapping: Y and Z are adjacent

Lac operon operon은 Promoter, Operator, structural genes으로 구성된다. 구조유전자의 경우 polycistronic mRNA에 의해 Z, Y product가 만들어지며, 각각의 기능은 lactose 분해와 흡수이다. 2. Promoter의 결실은 아무런 단백질도 합성할수 없게 된다. 3. operator는 repressor단백질이 결합하는 곳이다. 4.repressor가 operator에 결합하면 전사가 일어나지 않는다 (repressor는 constitutive low expression). 5. inducer는 repressor에 결합하여 3차구조의 변화를 유도하여, repressor가 operator로부터 해리하도록 한다.

문제점 1. inducer (lactose- allolactose)가 어떻게 세포내로 들어오는가? A: some inducer는 permease 없이 세포내로 들어올수 있다. B: 아니면, some permease는 inducer없이 만들어질수 있다 (true). Gratuitous inducer and background constitutive expression (P2 promoter, or just Lucky)

glucose (catabolite repression) Glucose 존재시에 lac operon은 작동하지 않는다. A. Glucose가 inducer에 의한 repressor의 inactivation을 방해한다 B.  lac operon 발현을 위해 repressor의 제거이외에 다른 것이 필요하다  (true) -> Glucose-6-phosphate 합성을 할 수 없는 mutant의 경우 glucose가 존재하더라도 IPTG에 의해 lac mRNA가 합성 된다 (또 다른 effector는 cAMP이다). -> CAP- 또는 adenyl cyclase- mutant는 lac mRNA를 생산할 수 없다.

cAMP and CAP(catabolite activator protein) cAMP는 adenyl cyclase에 의해 ATP로부터 생산된다. Glucose가 고갈될 경우 cAMP농도는 증가 CAP: cAMP와 complex형성하며, promoter에 결합부위를 가진다 (cAMP-CAP complex: positive regulator). Mal, Lac, Ara등 다른 operon 에도 영향:  catabolite-sensitive operon 실험적 증거: 1.      - in vitro에서 RNA polymerase의 Lac DNA결합은 cAMP-CRP 존재에 의해 증가된다 2.      - 만약 RPase가 결합된 후에는 repressor첨가에 의해 전사가 영향받지 않는다. 3.      - repressor가 먼저 operator에 결합하게 되면 RPase가 lac DNA에 결합하지 못하지만 매우 약한 일시적인 결합은 여전히 관찰된다. - nuclease protection assay: cAMP-CRP결합부위는 inverted repeat 구조이다

Gene 의 위치에 의한 유전자 발현의 조절 (polycistronic mRNA의 경우) In Lac operon Z : Y : A = 1 : 0.5 : 0.2 by transcription and translation coupling by increased degradation rate of mRNA at A gene than z gene

The Galactose operon galactokinase, galactose transferase, galactose epimerase,

gal operon은 galactose에 의해 유도되지만 glucose에 의해 저해되는가? (not likely) 1. 글루코스 존재시에 gal enzyme이 합성되는 경우 (S2 promoter) 2. 글루코스 부재시에 gal enzyme이 합성되는 경우 (S1 promoter)

gal operon에 있어 cAMP-CRP의 역할은 무엇인가?

두개의 promoter를 가지는 이유 – galactose has two roles in cellular metabolism) Gal: carbon source and cell wall component 세포 성장에 필수적인 galactose epimerase가 지속적으로 합성되어야 하고, 이 구성적 합성은 S2 promoter에 의해 가능하다.

Arabinose operon (inducer is arabinose) Ara BAD, Ara C, Ara E, AraF, pBAD, pC로 구성되어 있으며, AraE, AraF는 멀리 떨어져 다른 cluster를 이룬다. AraC regulator는 positive and negative regulation 이 가능 1. Ara C의 돌연변이 araBAD mRNA 합성을 할 수 없다. 2. Ara C 단백질은 arabinose 와 결합하면 구조적 변형이 유발된다 Pr + arabinose  Pi (Pr: repressor, Pi : activator) : Pr, Pi transition. (명심: repressor in Lac, Gal – negative regulator, cAMP-CRP in Lac, Gal – positive regualtor) 3. AraC 단백질은 스스로의 발현을 억제한다.  Autoregulation

Autogenous regulation of AraC protein in Arabinose operon AraC protein의 발현은 pC에 의해 조절되며, 이는 cAMP-CRP가 관여 AraC에 의해 만들어진 Pr이 arabinose에 결합하여 Pi가 되면 pBAD에 RNA polymerase가 결합한다.  Ara operon expression cAMP-CRP complex는 pBAD와 pC에 RNA polymerase결합을 촉진. pC의 RNA polymerase 결합부위(A site)는 Pr, Pi와 경합한다. 즉, AraC protein의 양이 증가될 때 Pr > Pi 인 경우 AraC 발현 자체가 저해된다. Pr < Pi 인 경우 역시 AraC 발현은 조정된다 (이 경우, Pi의 B site, A site의 결합상수, 결합속도가 Ara operon의 발현량을 결정하게 된다

Ara operon의 전사조건: glucose absent, cAMP production(adenyl cyclase) Okey, CAP ok.

DNA looping model. Glucose high, Arabinose low

Glucose low, Arabinose high

Tryptophan operon : Ananbolic control in prokaryote. trp operon: trp 합성을 관여하는 유전자들의 발현을 조정 즉 세포가 이용할 수 있는 trp 존재시 합성관련 유전자들의 발현을 중지시키고, trp 의 농도가 모자라서 고갈되면 trp 합성을 증대시킨다. Glucose와 같은 이용 가능한 당의 분해대사와 무관함 ; 실제 cAMP-CRP는 발현조정에 무관함. trp 생산에는 5개의 유전자가 필요하며 (trp E, D, C, B, A), 이의 발현조절을 위해 promoter, operator가 존재하며, 부가적으로 attenuator가 존재한다. (합성 operon의 특성: ex, histidine operon)

- Promoter와 operator는 60 bp로 overlap되어있으며, repressor가 결합하면 promoter가 결합할 수 없다.   trp operon 역시 기본적으로 repressor에 의한 on-off system 이지만, attanuator에 의한 이차조절이라는 측면에서 분해 관련 operon과 궁극적으로 다르다.

Leader sequence내의 attenuator 분해 유전자 발현 조절계와 달리 오퍼레이터 뒷부분과 구조유전자 시작부분 사이에 여분의 리더 시퀀스가 존재 Leader sequence의 제거는 trp operon의 발현을 6배 정도 증가시킨다.  leader sequence은 operon 발현을 조절… 리더 시퀀스는 그 합성 아미노산을 다수 코딩함. 즉, 세포 생리상태의 이중 check.

리더 시퀀스의 서열의 오묘함

Leader sequence 결합 여부에 따른 전사 종료.