Chapter 2. Enzyme

Enzyme 효소는 생명체 내부의 화학 반응을 매개하는 고분자 단백질 촉매임. 효소는 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 형성함으로써 활성화 에너지를 낮추는 역할을 함. 효소는 특이적이고 다양하며, 매우 효과적인 생촉매임. 효소의 이름은 –아제 (-ase)로 끝남.

Enzyme 단백질 효소들은 효소 활성을 위하여 비단백질기를 필요로함. - 금속이온: Mg, Zn, Mn, Fe 등 - 보조효소 (coenzyme): NAD, FA, CoA 와 일부 비타민 Holoenzyme = Apoenzyme + Coenzyme

효소 분류

Enzyme 단백질 효소들은 효소 활성을 위하여 비단백질기를 필요로함. - 금속이온: Mg, Zn, Mn, Fe 등 - 보조효소 (coenzyme): NAD, FA, CoA 와 일부 비타민 Holoenzyme = Apoenzyme + Coenzyme

효소의 작용 활성화 에너지 낮춤 자유에너지 또는 반응 평형 상수에는 영향을 끼치지 않음

효소의 작용 효소-기질 복합체

효소 속도론 효소 촉매 반응: Michaelis-Mention 속도론 또는 포화속도론 효소 반응시 기질 농도에 따른 초기속도의 의존성

효소 속도론 단순효소 속도론의 수직적 모형 산물생성속도 또는 기질소모속도 (moles/L·s) ES 복합체의 변화속도 효소에 대한 보존식:

효소 속도론 빠른 평형 가정 - 빠른 평형 가정은 효소와 기질이 반응하여 ES 복합체를 형성하는 과정이 빠르게 평형상태에 도달한다고 가정한다면 평형상수를 사용하여 [ES]를 [S]의 함수로 표시할 수 있다는 것임. 평형상수: 만일 효소가 보존된다면,

효소 속도론 유사평형상태 - 효소-기질 반응이 포화형태의 속도론을 보이긴 하지만, 많은 경우 빠른 평형가정은 물질 이동 속도식에는 적용되지 않음. - 대부분의 실험은 초기에는 효소농도에 비해 충분히 높은 기질농도를 유지하는 회분식 반응기를 이용함. - 효소 농도 가 충분히 낮기 때문에 라고 가정하면,

효소 속도론 유사평형상태 이전 두 식을 에 대입해서 정리하면,

효소 속도론 유사평형상태 이므로, 대입해주면 식은 (Dissociation constant)과 같이 정의하면 Km 값이 작으면 High affinity를, Km 값이 크면 Low affinity를 가짐.

효소 속도론 – 속도상수 결정 이중역수 도포 (Lineweaver-Burk 도표) Vm 을 정확히 구할 수 있지만, 정확한 Km 값의 결정은 매우 어려움. 낮은 기질 농도에서 구한 실험값은 높은 기질 농도에서의 실험값보다 직선의 기울기와 절편에 더 큰 영향을 미침.

효소 속도론 – 속도상수 결정 Eadie-Hofstee 도표 양 축에 v를 포함하고 있으므로 큰 오차가 발생될 수 있지만 낮은 값의 [S]에 대해서는 비교적 작은 오차를 나타냄.

효소 속도론 – 속도상수 결정 Hanes-Woolf 도표

효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델 알로스테릭 효소 (Allosteric enzymes) - 알로스테릭 또는 협동결합 (cooperative binding) 은 하나 이상의 기질결합부위를 가지고 있는 효소가, 기질이 효소와 결함하면 다른 기질 분자의 결합을 촉진하는 현상을 말함. - 조절효소 (regulatory enzyme)이 이 현상을 따름. - 속도식: 여기서 n은 협동계숙 (cooperativity coefficient)이고, n>1은 양성협동상태를 나타냄.

효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델 알로스테릭 효소 (Allosteric enzymes) - 협동계수는 으로부터 위의 그래프와 같이 과 을 도식화함.

효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델 저해반응에서의 효소속도론 - 어떤 물질은 효소와 결합하여 효소의 활성도를 감소시키는데 이와 같은 물질을 효소저해제 (enzyme inhibitors)라고 함. - 효소 저해 반응은 가역적이거나 비가역적임. - 가역적 효소 저해 반응은 경쟁적, 비경쟁적, 그리고 반경쟁적 저해 반응의 3가지 형태로 구분됨.

효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델 저해반응에서의 효소속도론 - 경쟁적 저해제는 구조가 기질과 매우 비슷하여 저해제와 기질이 효소의 활성부위를 놓고 경쟁함. - 효소-저해제 복합체가 형성되면 기질과 결합할 수 있는 효소의 양이 줄어들고 따라서 반응속도가 감소함.

효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델 저해반응에서의 효소속도론 - 여기에서 - 여기에서 경쟁적 저해반응에 의한 실제 효과로는 K’m,app 의 증가와 이로 인한 반응속도의 감소임. 경쟁적 저해반응은 기질농도를 높임으로써 극복됨. 경쟁적 저해제 (좌), 비경쟁적 저해제 (우)의 그래픔

효소 속도론 – 복잡한 효소속도론의 모델 비경쟁적 저해제는 기질과 유사성이 없음. - 저해제는 효소의 활성부위가 아닌 다른 부위에 결합하여 기질의 효소에 대한 친화성을 감소시킴.

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 pH 효과 - 어떤 효소들은 활성부위에 이온을 갖고 있으며, 이들 이온은 효소의 촉매기능을 위해 적합한 형태로 존재하여야 함. - 반응액의 pH가 변하면 활성부의 이온형태가 변화되고, 효소의 활성도가 바뀌게 되고 결국 반응속도고 변함. - pH의 변화는 또한 효소의 3차원 구조에 영향을 미치기 때문에, 효소는 특정 pH영역에서만 활성을 가짐. - 반응액의 pH는 효소의 최대반응속도와 Km값 그리고 효소의 안정성에도 영향을 미칠 수 있음. - 기질 자체가 이온기를 갖고 있어서 반응액의 pH에 의해 효소에 대한 기질의 친화력에 영향을 미치는 경우도 있음.

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 pH 효과 효소의 최적 pH

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 pH 효과 - 이온화 효소에 대한 효소반응속도와 pH의 영향. - 속도식 또는

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 pH 효과 - 속도식 또는 여기에서 - 결과적으로 효소의 최적 pH는 pK1 와 pK2 사이에 존재함.

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 pH 효과 - 이온화된 기질의 경우 아래의 반응경로와 속도식을 전개할 수 있음.

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 온도의 효과 - 효소-촉매반응의 속도는 일정 한계까지 온도에 따라 증가함. - 특정 온도 이상이 되면 효소가 변성되어 온도가 증가하여도 효소의 활성도는 오히려 감소함. - 효소는 최적온도가 존재하는데, 증가하는 영역을 온도활성화라고 함. 이때의 반응속도는 Arrehenius 식을 따름.

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 온도의 효과

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 온도의 효과 - 감소하는 영역을 온도 비활성화 또는 열변성이라고 함. - 온도에 의한 변성속도는 초기효소 농도이고 kd는 비활성상수임. - kd: Arrhenius 식의 형태로 온도에 따라 변함. Ed는 비활성화 에너지 (kcal/mol)임. - 결과적으로

효소 속도론 – pH와 온도의 영향 온도의 효과 - 효소-촉매반응의 활성화 에너지의 범위는 4 ~ 20kcal/g·mol 정도임. - 비활성화 에너지 Ed 는 40~130 kcal/g·mol 정도임. - 온도에 의한 효소의 변성은 효소 활성화보다 급속하게 일어남.

효소고정화 효소 고정화: 한정된 공간 속에 효소의 이동성을 제한하는 것임. 효소를 고정화 시키면 효소 재이용이나 효소의 회수 및 정제공정의 생략과 같은 장점이 있음. 효소 활성을 위하여 더 좋은 환경이 마련될 수도 있음. 효소의 값은 비싸므로, 효소의 재 사용은 많은 공정에서 핵심적인 요소임.

효소 고정화

효소고정화 고정화 효과 - 고정화 효소의 확산저항은 여러 수준에서 관찰됨. - 이러한 저항은 지지체의 특성 (공극성, 비공극성), 지지체 주위의 유체역학적 조건, 효소의 지지체내부 또는 표면의 분포에 따라 변함. - 확산저항이 효소반응속도에 미치는 영향은 효소 반응속도와 기질확산속도의 상대 값에 따라 다름. - 상대속도는 Damkoehler (Da) 수에 의해 규정됨. 는 용액중의 기질농도 , 은 물질전달계수 (cm/s)

효소고정화 고정화 효과 - 효소전환속도는 Da 값에 따라 효소반응속도 또는 기질확산속도에 의해 제한 받을 수 있음. - Da >>1 이라면 확산속도에 의해, Da <<1 이라면 반응속도에 의해 제한 받는 것이고, Da ≈ 1 이라면 반응과 확산저항이 비슷한 것임.

효소고정화 비공극성 지지체 표면에 부착된 효소의 확산효과 - 효소가 비공극성 지지체 표면과 결합하여 균일하게 분포되어 있고 모든 효소가 똑같은 활성을 가지며, 기질은 다음 그림과 같이 지지체 표면 주위의 얇은 액막을 확산 통과하여 반응이 일어나는 표면에 도달한다고 가정함. - 고정화 공정은 효소 구조는 물론 고유속도상수 (Vm, Km)를 변화시키지 않는다고 가정함.

효소고정화 비공극성 지지체 표면에 부착된 효소의 확산효과 - 정상상태에서 효소 반응 속도는 물질전달 속도와 같음. V’m 은 외부표면적당 최대반응 속도이고, kL은 액체물질전달계수임. - 물질전달에 의해 강하게 제한 받을 경우 (Da >>1), 즉 일 때, 효소반응이 물질전달보다 빠르므로 효소계는 겉보기 일차반응을 나타냄.

효소고정화 비공극성 지지체 표면에 부착된 효소의 확산효과 - 효소반응이 제한받을 때 (Da <<1), 반응속도는 - 겉보기 Michaelis-Menten ‘상수’ 는 교반속도의 함수임. 보통 Km,app는 값처럼 실험으로 측정되며 최대반응속도의 절반 값을 나타냄.

효소고정화 공극성 격자 속에 고정화된 효소들의 확산효과 - 효소가 다공성 격자의 내부 공극 표면에 고정화되었을 때 기질은 공극사이의 비꼬인 통로를 통해 확산한 뒤에야 비로소 공극표면의 효소와 반응함.

효소고정화 공극성 격자 속에 고정화된 효소들의 확산효과 - 효소가 구형지지입자 속에 균일하게 분포되어 있고, 효소가 Michaelis-Menten 기작을 따르고 지지체 안팎에 기질농도의 변화가 없다면, 다음 식처럼 정상상태에서 확산속도와 반응속도는 서로 같다고 할 수 있음. - 경계조건은 r = R 일 때 , r=0 일 때 임. 여기서 Vm 은 지지체의 위 부피당 최대반응속도이고, De는 공극 격자 안에서의 기질의 유효확산계수임.

효소고정화 공극성 격자 속에 고정화된 효소들의 확산효과 - 고정화된 효소의 진정한 고유 속도 상수를 얻기 위하여 작은 크기의 입자를 사용하거나 입자 주위를 강하게 저어 주거나, 높은 농도의 기질을 사용함으로써 확산저항을 제거하여야 함.

효소의 대규모 생산 대량으로 생산되는 효소는 주로 과잉생산균주로부터 생산됨. 생물체로부터 특정한 효소를 분리, 정제하기 위해서는 다양한 분리, 결정화와 건조과정 등이 필요함. 공정의 체계는 효소가 세포 안에, 혹은 세포 밖에 있는 가에 따라 달라짐. 어떤 경우에는 효소활성은 유지하고 있으나 나머지 기능은 불활성화 되어 있는 세포를 고정화된 형태로 사용하는 것이 더 유리할 수 도 있음.

효소의 대규모 생산 효소의 대규모 생산의 첫 단계는 효소를 생산하는 생물체를 배양하는 것임. 효소의 생산은 제어될 수 있으며, 효소의 과잉생산을 위하여 배양조건을 최적화 할 수 있음. 배양단계가 끝나면 배지로부터 세포를 분리하는데, 보통은 여과를 이용하나 때로는 원심분리도 이용함. 효소가 세포 안 또는 세포 밖에 있느냐에 따라 효소의 분리, 정제를 위해서 세포나 배양액을 더 처리하기도 함.

효소의 대규모 생산 어떤 경우에는 효소가 세포 안과 밖에 공존하는 경우가 있음. 이러한 경우에는 배양액과 세포를 동시에 처리하여야 함. 세포내 효소는 세포막의 투과성을 향상시켜 배양액으로 분비시킬 수 도 있음. 이러한 목적을 위해 CaCl2와 같은 염류나 DMSO와 같은 화학약품, 또는 pH 전이가 사용되고 있음. 효소의 분비가 완전하지 않다면 세포를 파괴해야만 함.

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