RFMP vs. HPV 28 2014년 4월 23일 학술마케팅본부

◆ 여성이 무서워하는 암 1위 “자궁경부암” 한국 여성들에서 빈발하는 7가지 암중에서 가장 두려운 암은? 자궁경부암 (33.3%) 유방암 (30.6%) 위암 폐암 대장암 간암 갑상선암 자궁적출로 인한 임신, 출산에 미치는 악영향 여성의 상징이 제거된다는 상실감 대한산부인과학회 설문조사 한국일보, 헬스조선

자궁경부암은 다른 암과는 달리 원인이 명확하고 ◆ 자궁경부암과 다른 암의 차이 자궁경부암은 다른 암과는 달리 원인이 명확하고 암전(前)단계가 길어 조기 진단이 가능하다 자궁 경부암 암 전(前) 단계 5~15년 후 암으로 발전 0기 암 HPV 감염 상피 이형증 (1/2/3) 암 전 단계에 조기 진단이 가능 유전자 돌연변이… 난소암 효과적인 조기 검진 방법이 확립되어 있지 않음 암 1기 암 2기 암 3기 암 4기 유전자 돌연변이… 폐암 조기 검진 방법이 확실히 정립되지 않음 암 1기 암 2기 암 3기 암 4기 국가암정보센터

◆ 발 암전(前) 검진으로 100% 예방 가능 1, 2) 5~15년 후 암으로 발전 정상 세포 HPV 감염 상피 이형증 자궁경부암 암 전 단계 0기 1기 2기 3기 4기 정상 세포 HPV 감염 상피 이형증 (1/2/3) + 방사선, 항암제 주기적인 검진 광범위 자궁 적출 술 자궁, 나팔관, 난소, 자궁주위 조직, 질상부, 골반림프절 절제 원추절제술 발병 부위만 제거 레이져 요법 치료 방법과 치료의 강도 다른 암에 비해서 암전(前)단계의 조기진단으로 암발병을 예방할 수 있는 이유 치료 비용 : 1,600만원 2) 환자 1명당 비용 부담 (의료비 일체) 1) 대한산부인과학회, 국가암정보센터 2)국립암센터

◆ HPV DNA 검사는 획기적으로 암발생을 낮춰준다 유럽 사례 1) 대상 국가: 스웨덴, 네덜란드, 잉글랜드, 이태리 관찰 대상: 17만 명 대상 비교 방법: 세포진 검사*만 시행 VS. HPV DNA 검사 도입 주관: 국제 HPV 스크리닝 working 그룹 외 자궁 경부암 발생율 (%) 결과 분석 100 60~70% 감소 HPV DNA 검사가 세포진 검사보다 정확하기 때문. 30~40 그럼에도 불구하고 암이 발생되는 이유는 기존 HPV DNA 검사법의 한계 때문. 여기에 정확한 HPV DNA 검사가 도입된다면 암은 100% 예방이 가능함. 30~40% 유지 세포진 검사만 시행한 그룹 HPV DNA 검사에 참여한 그룹 * 1950년 경 처음 도입된 검사 방법 Thelancet nov 3, 2013

◆ 정확한 HPV DNA 검사로 자궁경부암 100% 예방 “현재” 4천 여명 발생/년 1) 여성들이 HPV DNA 검사를 안다면, HPV DNA 검사의 효과 기존 HPV DNA 검사의 부 정확성 하루에 3명 사망 1) 여성이 무서워하는 암 1위 “자궁경부암”으로 부터 해방 발생률, 사망률 감소 세포 검사 + 선택적인 HPV DNA 검사 전국민이 정확한 HPV DNA 검사 참여 홍보 부족 소수의 여성만이 검사에 참여 나라지표, 국가통계 포털

◆ 자궁경부암 암화과정에서의 HPV HPV Infected Cervix Normal Cervix CIN3, Precancer Persistence(지속) (1 to 10 years) Infection Invasion(침범) HPV Infected Cervix Normal Cervix CIN3, Precancer Cervical Cancer Clearance(소실) Regression(회귀) Mild Cytologic Abnormality Schiffman M,et al. J Natl Cancer Inst Monogr 2003;(31):14–9.

Probable High-Risk type ◆ HPV genotype의 임상적 분류체계 Classification Type No. High-Risk type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 15 Probable High-Risk type 26, 53, 66 3 Low-Risk type 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, CP6108(89) 12 표 1. HPT genotype의 분류, 72,81,89는 HPV 28에 미포함 Reference Nubia Muñoz et al. The New England Journal of Medicine 2003;348:518-27. (교신저자 Chris J.L.M. Meijer, 2014년 4월 현재 4766회 인용) ㅇ Reference에서 각각의 HPV type에 대해 임상적 통계의 근거로 3개 군으로 분류함. ㅇ 150 여개의 다양한 HPV type 중 통계적 의미를 가지고 분류된 Type은 30종 High-Risk (15 종), probable high-risk(3)로 분류된 18종으로 한정 ㅇ 분류되지 못한 다양한 HPV type을 검출하는 것은 임상적으로 의미가 없는 양성 결과를 산출하는 원인. ㅇ World Health Organization(WHO) Internal Agency for Research on Cancer(IARC)의 분류기준에서도 자궁경부암으로 진행되는 증거를 토대로 Carcinogen으로 분류된 Type은 12종이며, 가능성이 있는 것으로 분류된 Type 이 13종임. (총 25종) ㅇ 자궁경부암 환자에서 각 상위 15개 High-risk HPV genotype 의 비중이 95%를 차지함 (Meta-analysis(14,500 cases))

◆ HPV genotype의 필요성 자궁경부암 환자에서 각 HPV genotype 별 percentage IARC pooled analysis (3,085 cases) Meta-analysis(14,500 cases) 16, 18 유전형은 자궁경부암 case의 단지 70%만 차지함, 나머지 유전형의 정보를 제공해야 자궁경부암 95%를 커버할 수 있음

◆ 조직학적 유형에 따른 HPV genotype 분석 HPV type Risk Overall % Histological type SCC % ADC % Any 89.9 90.9 82.0 Single 79.0 79.4 73.4 Multiple 11.2 11.6 9.3 1 HPV16 HR 56.6 59.3 36.3 2 HPV18 16.0 13.2 36.8 3 HPV58 4.7 5.1 1.5 4 HPV33 4.6 4.9 2.2 5 HPV45 4.5 4.4 5.2 6 HPV31 3.8 4.0 2.3 7 HPV52 3.4 3.6 1.2 8 HPV35 1.7 1.9 0.6 9 HPV59 1.3 1.4 0.8 10 HPV39 11 HPV51 1.0 No HPV type Risk Overall % Histological type SCC % ADC % 12 HPV56 HR 0.8 0.2 13 HPV68 0.6 0.5 14 HPV11 LR 0.1 15 HPV53 PHR 16 HPV73 0.0 17 HPV6 0.4 18 HPV66 19 HPV70 0.3 20 HPV82 21 HPV69 22 HPV26 23 HPV34 24 HPV30 25 HPV85 Total N=~30,848 / SCC : squamous cell carcinoma(편평상피암종) / ADC : adeno/adenosquamous carcinoma(혼합암종) Reference Ni Li, et.al. Human papillomavirus type distribution in 30,848 invasive cervical cancers worldwide: variation by geographical region, histological type and year of publication. International journal of Cancer, 128, 927-935, 2011

Quantitative analysis ◆ Ideal method for HPV DNA test Assay Provided information Test system Genotype Co-infection Quantitative analysis Homogeneous Automation HPV 28 ◎ RFMP X DNA Chip Hybrid capture Real-time PCR △ DNA-Sequencing ◎ Provided(제공) △ Limited provided X Not provided ㅇ 바람직한 HPV DNA 검사는 임상적으로 유용한 genotype의 감염 여부(Co-infection) 에 대한 소멸(Clearance) 또는 지속(Persistance)의 정보를 정량적으로 제공하는 것

◆ RFMP 는 ㅇ 상품명 : RFMP® PapilloTyper ㅇ 신의료기술 - 검사명 : 중합효소연쇄반응 제한효소절편 질량다형법 PCR-RFMP(Restriction fragment mass polymorphism) - 신의료고시 : 보건복지부고시 제2011-115호, 2011년 9월 - 급여 고시 : 나595-2, C6094006 보건복지부고시 제2012-85호, 2012년 ㅇ 검사 방법 : PCR 방법으로 유전자를 증폭하고, 유전자질량분석이 가능하도록 제한효소로 절단(절편)한 후 MALDI-TOF MS를 이용하여 유전자형 결정부위의 염기서열을 측정 ㅇ 제조 및 판매 : 진메트릭스 Restriction 제한, fragment 절편, mass 질량, polymorphism 다형질

◆ RFMP 제품정보 항목 내용 비고 목적 HPV genotyping Method PCR-RFMP MALDI-TOP MS Capacity 96 test/run (384 test/run 가능) 장비에 장착 가능한 수 Soft Ware Auto PapilloTyper SW MS Data  Processing Genotype  Report Protocol 유전자증폭(2회)  제한효소 처리  탈염  질량분석 Marketing Point 검출 가능 유전형이 현존 최대 74 광대역 유전형 정확성 직접분석법 민감도 분석민감도 50~100copy/assay, 임상민감도 96.2 % 특이도 임상특이도 92.1% 암예측력 Genotyping 논문 및 평가자료 (6편) 1. 고해상도 진단법 Nature Protocol, 2008 2. 차별화된 검사방법(직접분석법) –진단검사의학회 주관 아산,삼성,중앙대,원자력, 일산백, 녹십자 공동 대한진단검사학회지, 2007 3. 국내시판중인 HPV 검사시약과의 비교평가 보건복지부 보건의료기술진흥사업 최종 보고서 (진단검사의학회 HPV 연구회), 2010 4. 높은 임상민감도와 특이도 JMV. 2011 5. Roche Linear Array에 비해 우수 JMV. 2012 인증 신의료기술(2011), 급여대상결정(2012), RFMP 특허 등록

◆ RFMP 제품 정보 Wide Spectrum : HPV type의 임상적으로 툥용되지 않는 모호한 개념의 용어 식약처 허가사항과 다른 Homepage 내용 (http://www.genematrix.net/product_03.htm)

◆ RFMP 중복 감염 검출 능력 1. 중복 감염의 검출 ① LA와의 비교에서 다중감염이 빈번한 HPV genotyping 검사에 2개 이상의 감염에 대한 정확한 정보를 주지 못함 ② 다중감염에서 중요한 type을 검출하지 못할 경우, 임상적으로 중요한 핵심 정보가 제외될 수 있음. ③ Direct sequencing과의 비교에서도 상당수 다른 결과를 보임(23 case 중 13 case) 2. PCR-RFMP 방법의 검출상의 근본적 한계 2개 또는 그 이상의 중복감염은 peak 패턴 분석으로 검출되기 어렵거나 부정확한 결과를 산출. Reference Hyo-Pyo Lee et al. Journal of Clinical Virology 57 (2013) 130– 135 (진매트릭스 논문에서 발췌)

◆ RFMP 중복 감염 검출 능력 RFMP 방법의 중복감염 검출능력의 근본적 문제점 RFMP 방법은 다중감염일 경우 검출양상과 다른 결과를 보이기 때문에 다중감염의 검출에 부적합. 예) HPV 16, 18, 45 type의 다중감염 시, HPV 16, 18, 45, 70, 68/73 의 결과가 도출됨

◆ RFMP 검사 과정, TAT RFMP HPV 28 Real time PCR VS RFMP 실험 과정(48개 샘플기준) Extraction 1st PCR Digestion Chip에 옮기기 Desalting AM 9:00 PM 12:00 PM 5:00 PM 7:00 PM 8:30 PM 11:00 Specimen 3hr 30min 1.5hr 2hr PM 3:00 2nd PCR Drying PM 7:30 1hr PM 10:00 질량분석 Finish! HPV 28 3hr 3.5hr 5min Extraction Real-time PCR Analysis CFX96™ Seegene viewer Specimen AM 9:00 PM 12:00 PM 3:00 PM 3:05 Finish! Real time PCR VS RFMP 실험 과정(48개 샘플기준) PapilloTyper HPV 28 14 h 6.1 h

◆ RFMP 정량적 결과 [RFMP] 1. PCR 반응의 최종 산물을 대상으로 type을 검출하는 방법은 근본적으로 결과의 정량적 의미로 접근이 부적합 (DNA chip 방법도 동일) 2. Peak 의 높이로 정량적 의미를 부여할 수 없음 [HPV28] 1. cyclic-Catcher Melting temperature Analysis(cyclic-CMTA) 법을 이용하여 PCR cycle 중간에 형광 level을 측정  정량적 의미를 부여 (TOCETM Technology) 2. 각 Type 별로 (+++), (++), (+) 3가지 정량적 의미의 결과를 확인할 수 있다.

◆ RFMP 결과분석의 주관적 판단 [RFMP] [HPV28] ㅇ Peak 의 위치와 패턴, Background signal 등이 결과에 영향을 주며, 주관적 판단의 가능성 존재 ㅇ 동일한 검체의 결과에서도 peak 의 위치가 변동이 가능하여 근접한 peak에서 결과의 해석이 부정확함 Real time PCR 에서 detection 된 형광 level을 자동으로 검출하여 Seegene Viewer 에서 분석되어진 정확한 결과 확인

◆ RFMP 결과 판정기준 [ DPOTM and TOCETM ] [HPV28] ㅇDPOTM and TOCETM 기술을 이용한 Cross Reactivity의 완벽한 배제 ㅇ다중감염에도 정확한 결과 도출 [ DPOTM and TOCETM ] 결과판정 질량값은 Centrid 분석법을 사용하여 signal to noise 3, peak width 0.1 Da, percent height 80%, intensity 100 a.u. 이상의 조건을 만족한 peak에만 표기됩니다. 다음 조건을 만족하지 못해 질량 값이 표기되지 않은 peak은 결과판정에서 제외됩니다. 측정된 질량 값과 조견표 상의 질량 값의 바이어스는 0.1% 까지 허용합니다. 3. 판정 불가 혹은 재실험 (1) 본 제품이 분석하는 유전자 지역의 68형과 73형의 염기서열이 동일하여 68/73형으로 분석됩니다. [RFMP] ㅇ 실제 검체 실험에서 0.1% 이상 편차가 발생 되는 경우가 빈번하여 분석에 어려움이 있음. ㅇCross Reactivity HPV type 68과 HPV type 73의 구별 불가 PapilloTyper 사용설명서, 진매트릭스

◆ RFMP 주장 주장 HPV28의 대응방안 광대역 유전형 진단 ㅇ 74 종이 검출됨에 따른 임상적 의의 부재 ㅇ 홈페이지 광고상에는 74 종 검출로 기재, 메뉴얼상에는 46종 기재 식약처 허가사항과 다른 광고 ㅇ 모호한 언어 표현 (광대역 유전형의 개념 모호) 우수한 임상 성능 ㅇ 다수의 임상적 증명은 되지 않은 상태(일부 논문) 초정확 진단기술 (교잡반응법이 아닌 직접법) ㅇ HPV28도 교잡반응이 아닌 Real time PCR 법임 염기서열법(시퀀싱)과 비교시 높은 일치율과 중복감염 검출 우수 ㅇ 염기서열법은 중복감염이 있는 경우 우세하게 감염된 type을 감별하게 되므로, 낮은 농도로 감염된 type에 대해서는 위음성의 결과를 나타내는 경우가 많습니다. ㅇ 염기서열법 보다는 우수할 수 있지만, Real-time PCR 보다 우수하지 못합니다. 편리성 : 대용량 자동화 분석 (96 or 384 test/run) ㅇ 현존하는 HPV genotyping의 모든 방법 중 가장 불편하고 복잡하며, TAT가 길고, Hands on time 이 길다. (DNA chip 보다도) ㅇ 분석부분만 자동화 되어 있는 상황이며, 추출부터 PCR 의 자동화가 구축된 HPV28이 유리 Auto PapilloTyper SW ㅇ 자동 분석된 결과에 대한 신뢰가 힘들다는 검사자의 의견이 다수 ㅇ 주관적인 판단으로 결과를 내는 경우도 있으며, 숙련되지 않은 인원이 할 수 없음

◆ RFMP vs. HPV 28 HPV 28 RFMP Benefit HPV Genotyping 결과의 임상적 의의 HPV type coverage 28 종의 검출 46 종 또는 74 종의 검출 임상적 의의를 포함하지 않는 결과는 환자와 임상의에게 혼란을 초래 Quantification 감염 양상의 정량적 의미 HPV Genotyping 검사에 정량적 의미 부여 정확한 HPV Genotype 결과 Multiple infection 다중감염 양상에 대한 정확한 검출 능력 2 또는 3개 이상의 다중감염 결과 해석 불능 다중감염 양상의 임상적 의의 확인 / 정도관리의 질 향상 Contamination UDG system Homogenous system Nested PCR system 오염에 대한 근본 원인 제거 Consensus primer vs Type Specific Primer 각 type 에 대한 정확한 검출 PGMY consensus Primer는 type 별 검출 능력이 상이 정확한 HPV type 검출 Result Analysis of Precise Interpretation 주관적인 판정의 배제 분석 프로그램에서 결과 오류로 인한 주관적 판단 가능 결과분석의 주관적 판단 배제 극대화된 편의성 Process of Convenience 자동화 장비(핵산 추출) + Real time PCR (2 step) 핵산추출  PCR  전기영동  PCR  탈염  MS 점적  샘플 점적  질량측정 (9 step) 단순한 검사과정 TAT / Hands on Time 6.1 시간 / 40 분 14시간 / 5시간 1 day report 검사 인력의 활용 Contents for Genotyping 간단한 시약구성 다양한 추가 장비, 소모품 불필요 복잡한 시약구성 다양한 추가 장비, 소모품 필요 검사실 관리, 시약관리, 공간활용의 용이성 HPV 검사의 이상적인 검사 방법 제시 Genotyping, 다중감염, 정량적 정보, 오염관리 자동화, 신속성 ?

◆ RFMP 결과 비교_100건 중 1. 부분적으로 결과가 일치한 사례 (N=31) HPV28 RFMP HPV28 RFMP 1 58(+++),52(+++) 58 2 53(+++),61(+++) 53 3 70(+++),61(+) 70 4 68(+++),54(++) 68/73 5 52(+++),42(+++),54(++) 52 6 26(+++),53(+++),70(+++),61(+++) 26 7 58(+++),33(+++),39(+),26(+),61(++) 8 54(++),61(+++) 61 9 51(++),35(++),43(++) 43 10 52(++),53(+),43(+++) 11 52(++),35(+++),53(++) 35 12 66(++),58(+++),56(++),44(+++) 13 51(+++),52(+) 51 14 58(+++),31(++),69(++),53(++) 15 58(+),51(++),16(+++),53(+++),54(++),6(+++) 16 58(+++),42(+),11(++) HPV28 RFMP 17 56(++),31(+++),42(+++),11(+++) 11 18 51(+++),31(+),42(++),53(+),11(++) 51 19 66(++),42(+),6(+++) 6 20 51(+++),18(+++),68(+++),53(+++) 21 66(+++),42(+),53(+++),11(+) 66 22 66(+),59(+++) 59 23 66(++),39(+++),42(+),11(++) 39 24 66(+++),52(++) 25 66(++),52(++),6(+),11(+) 52,66 26 58(+),16(++),35(++),18(+) 16 27 52(++),44(++) 52 28 68(++),70(++) 45,68/73 29 58(++) 39,58 30 58(++),56(+),61(++) 58 31 68(+++),53(+),44(+++) 44

◆ RFMP 결과 비교_100건 중 2. 결과가 일치하지 않은 사례 (N=36) HPV28 RFMP HPV28 RFMP 1 66(++),59(++),39(+),42(++),53(+),61(+++),40(+++) 62 2 56(++) - 3 16(++),70(+++) 4 56(+),70(+) 5 31(++),61(++),44(+++) 72 6 31(++),61(+) 7 33(+++) Other 8 53(+),70(+) 9 16(+),56(+++) 10 58(+),42(+),43(+),61(+) 52 11 81 12 59(+++),33(+++),56(++),31(+++),53(+),54(++),70(+++),44(++) 83 13 68(++),54(+++) 55 14 66(++),45(++),18(+),53(+),61(+++),11(++) 15 66(++) 33 16 56(++),11(+) 17 66(+),42(+++) 18 66(+++),35(++) HPV28 RFMP 19 73(+++),42(+++),53(++) 62 20 33(++) 55 21 53(++),11(++) - 22 23 42(+) 61 24 31(++),54(+) 25 11(+) 26 11(++) 27 66(+),42(++),54(++),11(+) 28 68(+),43(++) 29 31(+) 30 54(++),70(++) 31 32 42(++) 33 52(+) 89 34 43(+) 35 43(++) 36 58(+)

◆ RFMP 결과 비교_사무소사례 No RFMP HPV 28 비고 1 Risk Unassigned Other Negative 일치 3 LR 6 HR 51(+++), 68(+++) LR6(+++) 4 HR 33 HR 33(+++) 5 HR 58 HR 53(++), 58(+), 68(++) 6 LR 54(++) 7 LR 62 HR 56(++) 8 HR 16, PHR 53 9 HR 39(++) 10 ※ 체험검사 진행기관에서 직접 기록한 결과 임상소견과 HPV 28의 결과가 일치하여 자사 의뢰 결정 HR : High risk, PHR : probable high risk, LR : low risk

◆ SWAT 분석 Strength(강점) Weakness(약점) Opportunity(기회) Threat(위협) One day Report 중복 감염여부 확인 정량적 분석결과 제공 최신 분자진단검사법(Real-time PCR) 보험급여 결과비교를 통한 검사의 우수성 확보 거래처의 결과 만족도 상승 현 대학병원에서 사용하는 곳 없음 다수의 유전자형 검출(47>28) Strength(강점) Weakness(약점) Opportunity(기회) Threat(위협)

◆ HPV28 Real-time PCR은 임상적으로 의의가 있는 HPV 28종의 검출(High-risk, Low-risk) HPV Genotyping 결과의 임상적 의의 다중감염 양상의 확인에 적합한 분자진단 기술 (DPO, TOCE) 검사 결과의 주관적 판독 배제 및 오염으로 인한 검사 결과 오류의 배제 검출 데이터의 불명확성 배제 정확한 HPV Genotype 결과 자동화 핵산추출 + PCR set up + Real time PCR Seegene Viewer를 통한 편리한 결과 분석 및 전산시스템 자동입력(LIS) 극대화된 편의성 HPV DNA 검사 방법의 이상적 결과 제시  바이러스 양 결과 보고를 통한 HPV 감염에 대한 관찰 가능 임상적 유용성 + 결과의 신뢰성 + 검사의 편의성 제시 이상적인 검사 방법의 제시

◆ 재단의 HPV28 Real-time PCR은 정확한 HPV 유전자형 구분(Accurate HPV genotyping) HPV 다중 유전자형 감염 발견(Detection of multiple HPV genotypes) HPV 감염에 대한 관찰(Monitoring for HPV persistence) 바이러스 양 결과 보고(HPV viral load) 신속한 결과 보고(One Day Report) 다양한 유전자형(genotyping)의 다중감염(Multiple infection) 여부 및 지속감염 여부를 정량적(viral load) 분석으로 신속(One Day)하게 보고