바이오융합기술프로젝트 바이오융합기술프로젝트 1 서강대학교 생명과학과 20050758 이윤주 M i c r o a r r a y 바이오융합기술프로젝트 1 서강대학교 생명과학과 20050758 이윤주

Contents DNA chip DNA chip 제작과정 DNA chip 결과 DNA chip의 적용 Conclusion References

DNA chip 연구방향 -DNA의 구조적 해석 -> 기능적 해석과 유전자들의 상호 연관성 (functional genomics) DNA chip이란? -어떤 슬라이드에 여러 가지 종류의 DNA염기가닥(sample clone)을 행렬 형태로 심어 놓은 것 -유전자 발현의 비교분석에 용이함

DNA chip 제작과정

DNA chip 제작과정 1 단계 PCR (Polymerase Chain Reaction) - Sample gene -> PCR로 증폭 - 적당량의 DNA확보 위함 - 1cycle 당, 2 chain 형성 -> 100cycle 당, 2^100 chain 형성 - Material : Forward and reverse primers, dNTP, Taq polimerase

<PCR 과정>

DNA chip 제작과정 2 단계 Electrophoresis(전기영동) - DNA Sample을 gel에 심은 후 전기를 걸어 sample의 각 성분이 크기에 따라 다르게 움직이는 성질의 차이로 분리 <전기영동법>

- 원하는 PCR product를 구분해낼 수 있고 그 크기도 알 수 있음 <전기영동 결과> Shigella V.vulnificus V.cholerae Salmonella V.vulnificus V.cholerae - 원하는 PCR product를 구분해낼 수 있고 그 크기도 알 수 있음

DNA chip 제작과정 3 단계 PCR product purification & Elution - gel에서 DNA가 있는 부분을 오려낸 후 spin column을 사용하여 정제 후 녹여냄 <DNA 녹은 후의 모습> <Purification & Elution>

DNA chip 제작과정 4 단계 Spotting <DNA chip 찍기> 384 well microplate에 옮긴 후, arrayer를 이용하여 amine coating slide에 찍어줌 9mm <Arrayer와 Pin의 Spotting>

DNA chip 제작과정 5 단계 반응시킬 cDNA & DNA 준비 1) cDNA 준비 - Enzymatic Lysis를 통해 bacteria에서 RNA를 추출 - Reverse transcription(역전사) : 불안정한 RNA -> 안정한 cDNA로 - cDNA를 형광색소(Cy5 : green)를 이용하여 표식 2) DNA 준비 - Vulnificus DNA를 multiplex PCR한 다음 Cy3(red)로 표식 각 cDNA와 DNA를 chip위의 DNA와 hybridization시킨 다음 laser로 scan하여 확인

DNA chip 결과 + <DNA 확인(Green–3Cye dye)> <RNA 발현(Red–5Cye dye)>

DNA chip 결과 <Chip에 나타난 DNA, 그리고 RNA 발현모습>

DNA chip 결과 문제점1) Nonspecific binding Solution -다른 균 DNA지역에도 Vulnificus의발현한 RNA가 붙어 붉은spot을 나타냄 -발현은 됐지만(red) DNA표시는 안 나타남(no green)-PCR이 잘되지 않음 Solution -hybridization 온도 높게 -붙는(반응) 시간을 줄여줌

DNA chip 결과 문제점2) High background Solution -배경이 지저분함 -잔류한 solutions흔적 -oil from skin or gloves -target처리에 사용된 ethanol이 형광을 일으킴 Solution -scan 전에 slide 확인 -wash buffer에 과도한 SDS사용억제 -wash 중에 slide가 마르지않게 빨리 실험수행 & SDS충분히 씻겨나가게끔 함

DNA chip 결과 문제점3) Particle Contamination Solution 먼지들로 인한 spot 오염 -깨끗이 처리되지 않은 slide나 coverslip에 문제 Solution -oil-free 압착된 N2로 slide와 coverslip의 먼지제거 -사용전 hybridization solution과 wash buffer를 filtering

DNA chip 요약 DNA Chip 위에는 서열을 아는 DNA들이 미리 붙여있음(spotting) 검색하고자 하는 DNA sample을 chip 위에 뿌려줌 -> 상보적 서열을 가진 것들만 chip 위의 DNA와 hybridization Scan하여 형광 확인 발현된 유전자의 종류를 알아냄 (dye를 통해 green : 특정세균의 gene의 존재, red: 특정세균의 gene이 발현함을 앎)

DNA chip의 적용 유전자발현 동시 대량분석 인체 질환 진단 및 monitoring 환경인자에 대한 생물학적 반응 연구 Pharmacogenomics (약물유전체학) 식품 안전성 검사

Conclusion DNA chip 기술은 수천개의 유전자를 대량으로 초고속 분석을 가능하게 하였다.

References http://www.snubi.org/~ys802/html/microarray.htm http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_11.php http://cafe189.daum.net/_c21_/bbs_search_read?grpid=v0na&fldid=H4h&contentval=0000Hzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz&nenc=pRKq9pHegwt.BgJ59sLmaA00&dataid=17&fenc=6gtjxMkB3NY0&docid=CDe3gmnd 이동호, 임상분자생물학, 1995, 펴냄홍, pp181-203 감사합니다.