Integrated Biotechnology Project Glucose sensor 화공생명공학 20041213 이택

4 5 1 2 3 Table of contents About OBJECT About THEORY About METHOD DATA & ANALYSIS 5 About DISCUSSION

1 About OBJECT GLUCOSE SENSOR 제 1 목차 About OBJECT 1

1 -Cyclic voltammetry 와 Chronoamperometry의 기본 개념을 이해하고 이를 이용한 기초적인 전기 OBJECT Introduction. Concept. About -Cyclic voltammetry 와 Chronoamperometry의 기본 개념을 이해하고 이를 이용한 기초적인 전기 화학 실험을 수행한 다음, 대표적인 바이오 센서 (bio sensor)인 당센서 (glucose sensor) glucose oxidase(GOD)를 이용하여 제작하고, 이렇게 제 작한 gluecose sensor를 사용하여 전기 화학적으 로 glucose를 측정한다. About OBJECT 1

2 About THEORY THEORY About THEORY 2

2 1.Cyclic voltammetry (순환 전압 전류법,CV) -시간에 비례하여 전위를 변화시킬 때에 흐르는 About THEORY 1.Cyclic voltammetry (순환 전압 전류법,CV) -시간에 비례하여 전위를 변화시킬 때에 흐르는 전류를 전류-전위 곡선으로 기록하는 방법을 전위 주사법(potential sweep method)이라고 하는데, 이것을 계속 반복해서 전위 주사하는 경우를 Cyclic voltammetry라고 부른다 (그림1.Cyclic voltammetry 의 퍼텐셜 프로그램) 2 About THEORY

2 2.순환 전압 전류 곡선의 형태 -정지 용액에서 정지 전극을 사용하여 가역적인 단순한 전극 반응에 CV를 적용한 경우. About THEORY 2.순환 전압 전류 곡선의 형태 -정지 용액에서 정지 전극을 사용하여 가역적인 단순한 전극 반응에 CV를 적용한 경우. (그림2. 가역 전극 반응 에 대한 cyclic voltagram) 2 About THEORY

2 About THEORY 2.순환 전압 전류 곡선의 형태 -전류 피크가 생기는 것은 과전압 증대와 수반하여 반응량 증가로 전류가 크게 되는 효과와 시간 경과에 수반하여 전극 근방의 반응물량 감소로 전류가 작게 되는 효과에 의한다고 설명된다. 즉 전위를 anode 쪽으로 주사하면, 과전압 증대에 따라 R의 산화속도는 증대하면서 전류는 커진다. 전류의 증대는 극표면에 있어서 R의 감소를 가져다 주어 마침내 0이 되고, 전류는 확산 지배로 된다. 반대의 경우도 이와 같다. 2 About THEORY

2 About THEORY 3.chronoamperometry -amperometry(전류측정법)는 그 명칭에 나타나듯이 전류의 측정에 기초하고 있다. 작용전극의 전위를 일정케하여 전류와 시간 관계를 측정하는 방법을 전위 스텝법 또는 chrono amperometry 라 하고, 전극 반응의 연구에 많이 이용된다. (그림3. 실제 chrono amperometry I-t 곡선) 2 About THEORY

2 4.한계전류 (limiting current) About THEORY 4.한계전류 (limiting current) -농도분극이 극심하게 일어나면 전극 근처에는 반응물의 농도가 0에 접근하여 과전위가 증가하더라도 전류세기는 일정한 값 이상으로 증가하지 못 하는 상황에 도달한다. 이 때 흐르는 전류의 세기를 한계 전류라 한다. -용액을 저어 줄 때와 저어 주지 않을 때는 위와 같은 그림으로 한계 전류가 나타난다.   (그림4. convection 유무에 따른 I-t 곡선) 2 About THEORY

2 About THEORY 5.3전극 셀 -실험 장치에서는 연구의 대상인 전극(작업 전극 working electrode)과 이의 상대 전극(상대전극 counter electrode)사이에 전류가 흐른다. 작업 전극의 전위에 따라서 전류의 세기를 측정하기 위하여, 별도의 기준전극을 작업 전극 가까이 두고 이 기준 전극에 대한 작업 전극의 전위를 읽고 그 값을 원하는 값과 비교하여 원하는 값과 일치하도록 상대전극과 작업적극 사이를 흐르는 전류를 빠르게 조절한다. 이것은 보통 자동화된 장치(일정 전위기:potentiostat)를 써서 간편하게 할 수 있는데, 이것을 3전극 셀 이라고 한다. 2 About THEORY

2 About THEORY 6.3전극 셀 (그림6. 3전극 셀 실험의 개념도) 2 About THEORY

2 About THEORY 7.Glucose Oxidase(GOD) -Glucose oxidase는 산소를 전자 수용체로 사용하여, β-D-glucose+H2O +O2 →D+ 글루코노락톤+H2O2 의 반응을 촉매하는 효소이다. 이 변화에 의해 과산화수소가 생성된다. (그림7. 실험에 사용되는 reaction scheme) 2 About THEORY

2 About THEORY 8.Enzyme Kinetcis -Michaelis와 Menten 은 효모의 가역반응에 의한 수크로스의 가수 분해 속도를 여러 가지 효소 농도 및 기질 농도에 대해 측정해서 다음과 같은 결과를 얻었다.     2 About THEORY

2 8.Enzyme Kinetcis -이를 변형하면 다음과 같은 식을 얻을 수 있다. About THEORY 8.Enzyme Kinetcis -이를 변형하면 다음과 같은 식을 얻을 수 있다. 이 식을 Michaelis-Menten equation 이라 한다. -이 식의 양변을 역수로 취하면 다음 식을 얻을 수 있다. 2 About THEORY

2 About THEORY 8.Enzyme Kinetcis -따라서 1/v를 1/[S] 에 대하여 플로팅한 것을 Lineweaver-Burk plot이라 한다. (그림8. Lineweaver-Burk plot) 2 About THEORY

2 About THEORY 9.Biochip -바이오칩은 DNA, 단백질 등 생물의 몸 안에 있는 다양한 성분을 이용해 칩을 만든 것으로, 생화학반응에 참여하는 생체분자들은 인접한 분자들과 산화-환원 상태가 다르다. (그림9. Biochip platform) 2 About THEORY

2 About THEORY 9.Biochip 이것을 구동력으로 생체분자 사이에 전자를 전달하면서 미세한 전류를 일정한 방향으로 흘려 보낸다. 각각의 구성성분을 배열한 후, 전기나 빛으로 자극하면 상태 구분이 가능한 전기적 응답신호를 보낸다. 이것이 컴퓨터의 전자소자와 같은 역할을 수행하는 생물전자소자인 바이오칩이다. (그림10. DNA Chip 을 이용한 암조직의 검출 ) 2 About THEORY

3 About METHOD HOW TO USE 제 1 목차 3 About METHOD

3 working electrode의 polishing 방법 About METHOD 1.CYCLIC VOLTAMMETRY working electrode의 polishing 방법 1. 0.3 μm 의 alumina powder를 2차 증류수에 분산하여 polishing pad 에 뿌리고, polishing pad에 glassy carbon working electrode를 평행하게 3~4분 정도 돌리면서 갈아준다. 2. working electrode를 EtOH 와 2차 증류수로 씻어준다. 3. working electrode를 EtOH 50%와 2차 증류수 50%를 넣은 튜브에 넣어주고 sonication 시켜준다.(2~3분) 4. N2 gas로 말려준다.   3 About METHOD

3 (2) Couple의 Cyclic voltammetry About METHOD 1.CYCLIC VOLTAMMETRY (2) Couple의 Cyclic voltammetry 1. 1.0 mM , 0.1 M KNO3 solution 5mL를 Electrochmical cell에 넣고 electrode를 그림1과 같이 배치시킨다. (산소를 제거할 필요가 있는 실험에서는 Ar gas를 purging 할 수 있다.) 2.Cyclic voltammetry program을 컴퓨터상에서 실행시킨다. 3.Cyclic voltammetry의 potential 범위, scan rate, current rage를 선택한다. (scan rate는 각각 10mV/s, 20mV/s, 50mV/s, 100mV/s, 200mV/s에서 실험한다.) 3 About METHOD

3 4. 프로그램 시작과 동시에 Cyclic voltammetry 기기를 sweep 한다. About METHOD 1.CYCLIC VOLTAMMETRY 4. 프로그램 시작과 동시에 Cyclic voltammetry 기기를 sweep 한다. (이 실험은 환원부터 실행되므로 negative scan을 실행하여 준다.) 5.Cyclic voltammetry을 얻는다. 3 About METHOD

3 About METHOD 2.chronoamperometry 1. 1.0 mM , 0.1 M KNO3 solution 2mL를 Electrochmical cell에 넣고 electrode를 그림7과 같이 배치시킨다. (산소를 제거할 필요가 있는 실험에서는 Ar gas를 purging 할 수 있다.) 2. 위의 용액을 이용하여 일정한 전압(환원전위)을 걸어준 후 바탕 용액만 있을 때 용액을 저어주지 않을 때 용액을 저어 주었을 때의 i - t 그래프를 비교해본다.   3 About METHOD

3 1. 백금 작업 전극(Pt working electrode)을 polishing 한다. About METHOD 3.GLUCOSE SENSOR 1. 백금 작업 전극(Pt working electrode)을 polishing 한다. 2. Polishing 한 백금 전극 표면에 GOD 1 μL를 loading 한다. 3. GOD 가 완전히 마른 후 GOD 를 전극 표면에 고정시키기 위해 Nafion 1μL 를 loading 한다. 4. 이렇게 준비된 작업 전극을 상대 전극(Pt counter electrode), 기준 전극(Ag/AgCl reference electrode) 과 함께 potentiostat에 연결하고 0.1 M, pH 7.0 phosphate buffer 5mL 에 담근다. 이 때 용액은 magnetic stirrer를 이용하여 계속 저어준다. 3 About METHOD

3 About METHOD 3.GLUCOSE SENSOR 5. GOD 에 의헤 glucose 가 산화되면서 생성되는 H2O2를 측정하기 위해 0.6 V(vs. Ag/AgCl)의 산화전압을 걸어준다. 6. Background 가 안정되면 0.25 M 의 glucose 를 micro-syringe 를 이용해서 20μL 씩 주입한다.(1 mM 씩 증가한다.) 3 About METHOD

4 About DATA DATA & ANALYSIS 제 1 목차 4 About DATA

4 (1) 10mV/s 의 전압을 가했을 때의 전류 변화 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY About DATA 4

4 -그림을 보면, 환원 peak와 산화 peak 가 이론적인 실험 결과에 비하여 조금 밀려서 나타난 것을 확인할 수 있다. Contents DATA 1.CYCLIC VOLTAMMETRY -그림을 보면, 환원 peak와 산화 peak 가 이론적인 실험 결과에 비하여 조금 밀려서 나타난 것을 확인할 수 있다. -이것은 작업 전극이 가지고 있는 자체적인 resistance effect와 실험 과정에서의 작업 전극 표면을 닦아주는 polishing이 충분히 이루어지지 못 했기 때문이라고 볼 수 있다. polishing이 제대로 이루어지지 않으면, 전극 표면에서의 resistance effect가 증가하게 된다. About DATA 4

4 Contents DATA 1.CYCLIC VOLTAMMETRY -위의 그래프에서 중요한 변수는 환원 peak에서의 전압 (Epa)과 전류,(Ipa) 산화 peak 에서의 전압 (Epc)과 전류(Ipc) 의 크기이다. 이 값들을 이용해서 Formal reduction potential(EO'), 반응에 참여한 전자의 수 등을 알 수 있다. -Formal reduction potential (EO') = (Epa + Epc) / 2 About DATA 4

4 Contents DATA 1.CYCLIC VOLTAMMETRY -또 전달된 전자의 숫자는 가역적인 peak에서 두 peak potential 사이의 차이에 의해서 알 수 있는데, 이는 다음과 같다.   Ev = Epa - Epc = 0.059 / n -실제로 Epa(0.291V) 와 Epc(0.203V)의 값을 넣어보면, 퍼텐셜 차이 Ev는 0.088이 나온다. 이 값은 우리의 예상 퍼텐셜 차이인 0.059와 차이를 보인다. About DATA 4

4 Contents DATA 1.CYCLIC VOLTAMMETRY -또한 가역적인 system 안에서의 peak current는 Randles-Sevick equation을 이용해 scan rate의 관계를 알 수 있다. Ip = peak current , A n = electron stoichiometry A = electrode area , cm2 D = diffusion coefficient, cm2/s v = scan rate, V/s 위의 식을 이용하여, (scan rate)1/2와 peak current의 관계를 알 수 있다. 이것들의 관계는 아래 에서 언급하였다. About DATA 4

4 (2) 20mV/s 의 전압을 가했을 때의 전류 변화 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY   About DATA 4

4 (3)50mV/s 의 전압을 가했을 때의 전류 변화 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY   About DATA 4

4 (4)100mV 의 전압을 가했을 때의 전류 변화 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY   About DATA 4

4 (5)200mV 의 전압을 가했을 때의 전류 변화 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY   About DATA 4

4 (6)위의 CV 들을 한꺼번에 겹쳐놓았을 때의 그림 비교 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY About DATA 4

4 Contents DATA 1.CYCLIC VOLTAMMETRY - 위의 그래프들을 한꺼번에 겹쳐 놓았다. 이를 보면, scan rate가 증가함에 따라서 최대 전압과 전류가 증가하는 양상을 확인할 수 있다. 이것은 scan rate가 증가하면서 전극에서 전자 교환을 하는 이온의 수가 증가함에 따라서 이를 방해하는 전자 교환 이온 외의 생성물들이 증가하면서 peak이 밀려나는 것이다. About DATA 4

4 (7)CV시 Peak에서 나타난 전압 및 전류값들 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY Epa(V) Epc(V) Ipa(A) Ipc(A) 10 mV/s 0.291V 0.203V -5.117e^-6A 4.747e^-6A 20 mV/s 0.294V 0.199V -7.044e^-6A 6.304e^-6A 50 mV/s 0.303V 0.191V -1.100e^-5A 8.845e^-6A 100 mV/s 0.309V 0.180V -1.498e^-5A 1.131e^-5A 200 mV/s 0.322V 0.173V -2.026e^-5A 1.336e^-5A About DATA 4

4 (8)환원 최대 전압(Ipa)과 scan rate의 관계 DATA Contents 1.CYCLIC VOLTAMMETRY (scan rate)^1/2 에 따른 각 각의 peak current 를 plot 하게 되면, 다음과 같이 peak current가 linear 하게 증가함을 알 수 있다. About DATA 4

4 2.chronoamperometry (1) convection 이 없는 경우의 시간 대 전류 변화 DATA Contents About DATA 4

4 Contents DATA 2.chronoamperometry -convection 이 없는 경우, 급격한 전압의 증가로 인한 전극 표면 근처의 농도 변화에 대해서 보면, 전압이 급격하게 줄어드는 것은 mass transfer에 limit이 걸려서 급격히 감소하는 것을 확인 할 수 있다. 이때의 limit을 한계전류라고 하는데, convection이 없는 경우,  한계 전류가 굉장히 작은 양으로 측정되는 것을 확인할 수 있다. About DATA 4

4 (2) convection 이 있는 경우의 시간 대 전류 변화 DATA Contents 2.chronoamperometry About DATA 4

4 Contents DATA 2.chronoamperometry -convection이 있는 경우, stirrer에 의해서 가라앉거나 닿지 않은 반응물들이 전극 표면에 닿아서, diffusion만 있을 때보다 더 많은 활성을 갖게 된다. 이것은 mass transfer가 convection이 없는 경우보다 더 크고, 한계전류도 큰 것을 확인할 수 있다. 이로 인하여 한계 전류는 convection이 없는 경우보다 더 큰 것을 알 수 있다 About DATA 4

4 (3) convection 이 없는 경우와 convection이 있는 경우의 시간 대 전류 변화 비교 DATA Contents DATA 2.chronoamperometry (3) convection 이 없는 경우와 convection이 있는 경우의 시간 대 전류 변화 비교 About DATA 4

4 Contents DATA 3.GLUCOSE SENSOR 전형적인 glucose 실험 결과 About DATA 4

4 Contents DATA 3.GLUCOSE SENSOR -Chronoamperometry가 시작된 후 back ground가 안정되면서 0.25M의 glucose를 2mM씩 8회 첨가하였다. -전체적인 그래프를 보면, glucose가 첨가되면, GOD에 의해 glucose가 산화되면서 생성되는 H2O2를 측정한 전류가 증가하게 된다. 그래서 아래의 그림에서 보는 것과 같은 선형적인 형태를 띠게 되는 것이다. About DATA 4

4 Contents DATA 3.GLUCOSE SENSOR - 위의 그래프에서, H2O2 산화에 의해 흐른 전류의 평균치와 넣어준 glucose의 농도를 이용하여 data table을 만들어보고, calibration curve를 그려보면, 아래와 같다. 농도(mM)   전류(μA)       0    0.3532       2    0.5285       4    0.7559       6    0.9002       8    1.0501       10    1.2360       12    1.3575       14    1.4402       16    1.5151 About DATA 4

4 Contents DATA 3.GLUCOSE SENSOR - 효소 반응에 의해 생성된 기질을 전기 화학 반응으로 측정한 전류는 반응 속도와 같다. 그러므로 Michaelis-Menten kinetics를 이용하여, Lineweaver-Burk plot을 그려보고 Michaelis constant(Km)을 구해본다. About DATA 4

4 Contents DATA 3.GLUCOSE SENSOR -위의 그래프에서 x=0 일 때 y값은 1/Vmax 이다. 이 값은 0.544이다.  이 값의 역수를 취하면, Vmax의 값은 1.838μA 이다. 그리고, 위의 그림과 Lineweaver-Burk equation을 보면, 1차 함수의 기울기의 값은 Lineweaver-Burk equation의 Km/Vm의 값이다. 여기서 우리는 Vmax의 값을 구했으므로 Michaelis constant(KM)을 구할 수 있다. 역시 이 값도 구해주면. 5.173mM가 나온다. About DATA 4

DISCUSSION & CONCLUSION 5 DISCUSSION About About DISCUSSION 5 제 1 목차 50

Click here to add header 5 Click here to add header Contents DISCUSSION 1.CYCLIC VOLTAMMETRY -CV실험에서는 scan rate에 따른 peak이 이론보다 많이 밀려서 결과가 나왔다. 이상적인 조건에서 실험을 수행하였을 경우, peak이 밀려서 나타나면 안 된다. 그런데도 peak이 밀려서 나타난 것은, 실험 조작 미숙과 실험 그 자체가 갖는 한계 때문일 것이다. About DISCUSSION 5

Click here to add header 5 Click here to add header Contents DISCUSSION 2.chronoamperometry -두번째, chronoamperometry 실험은 실험 자체도 비교적 단순하고, polishing과 같은 조금 까다로운 작업도 없었기에 비교적 무난하게 진행할 수 있었다. 실제로 나온 convection과 no convection의 차이 역시 극명하게 나타나서, 비교 분석하기도 수월하였다. About DISCUSSION 5

Click here to add header 5 Click here to add header Contents DISCUSSION 3.GLUCOSE SENSOR -glucose sensor 실험은 가장 까다로운 실험이었다. GOD의 보존 상태가 양호하지 않아서, 활성도가 떨어지는 것을 예상되었고, 게다가, 실험 중 발생한 noise도 많았고, 그래프의 해석 또한 임의적인 실험이었다. About DISCUSSION 5

Thank you. Q n A Time 54