5. 원유의 미생물 1. 종류와 유래 1. 종류와 유래 ☞ 착유환경에 따라 변화 초유:500~1000/ml -> Bulk tank:5000~2x104/ml * 착유단계별 미생물 수 변화 * 위생적으로 착유한 원유의 미생물 분포

5. 원유의 미생물 1. 종류와 유래 * Group 별 원유미생물 종류

5. 원유의 미생물 1. 종류와 유래 ☞ 한국원유의 미생물 분포 * 저온성 미생물 * 대장균군

5. 원유의 미생물 1. 종류와 유래 * 내열성 미생물 ☞ 미생물 오염에 미치는 영향 - 사육장 환경, 착유과정 * 축사의 물질별 미생물 오염

5. 원유의 미생물 1. 종류와 유래 * 착유과정의 영향 : 유두 세척이 우유 내의 미생물 수에 미치는 영향 ☞ 내열성 미생물 - 원유의 품질 유지에 있어 중요 -> 원유의 품질은 원유 중 세균수에 의존 - Microbacterium lacticum, spore -> 100% 생존 - Alcaligenes tolerans - Str. faecalis, Str. lactobacilli, Str. coryneform 등도 내열성 높음

5. 원유의 미생물 2. 원유의 미생물학적 성상 2. 원유의 미생물학적 성상 2.1 집유단계별 원유의 세균 오염원 (1) 착유 직후 - 500~2000/ml - 증식 온도에 따라 : psychrophile -> 호냉성세균 psychrotrophic -> 저온성 세균 mesophile -> 중온성 thermophile -> 고온성 thermoduric -> 내열성 - 종류와 균수 : 젖소의 건강 상태, 착유방법, 계절 등에 의해 변화 (2) bulk tank 내의 원유 - 저장 온도와 냉각속도 (3) 집유과정 중 - 세균 증식은 계속됨 - 주된 세균 종류 : 유산균, Micrococcus, Str. Microbacterium, Psd. Acinetobacter Flavobacterium, Coliform - 최근 저온성균의 비율이 높아짐 (4) 공장내 - 저유 탱크 : 저온성균 증식

5. 원유의 미생물 2. 원유의 미생물학적 성상 2.2 원유의 세균 오염원 (1) 유두 내부 - 외부로부터의 세균 침입 - 착유시간에 따른 세균수 변화 전착유 -> 1400~26800/ml 중착유 -> 430~920/ml 후착유 -> 120~550/ml (2) 유두 및 유방 외부 - 축사환경 청결 유지 - 착유 시 청결유지 중요 (3) 착유기 및 외부 용기 - 착유된 우유의 신속한 이송과 냉장

5. 원유의 미생물 2. 원유의 미생물학적 성상 2.3 원유의 품질에 미치는 미생물 영향 (1) 유방염유 - 유방염 원인균 : Str. aureus, Str. agalactiae 가 주요 원인 - 항생물질 남용에 따른 내성균주 발현 (2) 산패유 - 유산균, 대장균, Micrococcus등에 의해 산도 상승 -> 산응고 발생 - 대장균 -> 가스 발생 glucose -> CO2 + H2 (3) 점질유 및 착색유 - 점질유 : 미생물에 의해 Mucin, Dextran 생성이 원인 - 착색유 : 유산균의 공생, 색소 발생 저온 세균, 주위 환경(오수, 토양)이 원인 (4) Phage 오염유 - Bacterio phage에 오염 - 발견이 어려움 - 발효유,치즈 제조시 문제 야기 (5) 약제 오염유 - starter, 치즈 원료유의 응고 불능 사고 원인 - 페니실린->내열성있음 - 대책 -> 신속하고 sensitive한 항생물질 검출법 개발

5. 원유의 미생물 3 원유의 세균과 온도 3. 원유의 세균과 온도 - 좋은 원유 -> 좋은 유제품 - 좋은 원유 : 균형있는 영양소, 적은 세균수 - 저장온도가 중요한 factor 가 됨 - 낮은 저장온도, 낮은 최초균수 유지가 중요 ☞ 미생물 증식에 따른 효소생산의 영향 - 유당, 단백질, 지방의 분해 야기 -> 맛변화(106/ml 이상), 성상의 변화 - 법적 시유사용 요건 -> 세균수 105/ml 이하의 원유 - 생산된 효소와 대사산물 -> 살균 후에도 잔류 ->저온성 세균이 생산하는 내열성 효소 : protease : 유단백 분해 lipase : 냄새나는 butyric acid 생산 - 문제 해결 -> 세균수 줄이는 것 * 저장온도가 세균수 증식에 미치는 영향

5. 원유의 미생물 4 우유와 저온세균 4. 우유와 저온세균 ☞ 저온세균 : 최적발육온도 -> 20~25oC, 7oC 이하에서 증식 가능 ☞ 원유에서 발견되는 대부분의 저온세균 - 그람음성 Pseudomonas fluorescence, Psd fragi, Psd putrefaciens 3 종이 주류 - 내열성 protease 생산 -> casein 분해 -> 쓴맛 생성 -> 멸균후 gel 화의 원인 ☞ 발육온도에 따른 미생물의 구분

5. 원유의 미생물 4 우유와 저온세균 ☞ 저온세균이 차지하는 비율 - 총세균의 10% 이하 - 저온 저장 동안 지속적으로 성장 -> 저온세균의 비율 증가

5. 원유의 미생물 4 우유와 저온세균 ☞ 저온세균이 차지하는 비율

5. 원유의 미생물 4 우유와 저온세균 ☞ 저온세균의 문제 - 내열성 효소에 기인 - 저온세균의 70-90%가 생성 - phospholipase -> 지방구 분해 -> lipase 에 노출 - protease -> gel 화의 중요한 원인 (K-casein -> para-k-casein -> gelation) * Psd 의 내열성효소 특징

5. 원유의 미생물 5 우유의 병원성세균 5. 우유에 존재하는 병원성균의 특성 - 유발병 : 결핵, brucellosis, diphtheria, scaret fever, Q-fever, 위장염 - 주 원인균 : Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, E coli ☞ 병원성 미생물의 정의 : 감수성있는 숙주에 대해 질병, 감염 또는 중독을 일으킬 수 있는 미생물 (1) 병원성 미생물의 공통 특징 - 우유와의 관련성이 적다고 알려진 미생물에 의해 발병 - 발병원인 -> 오염된 원료, 첨가물의 사용, 부적절한 가공처리,… - 품질검사와 살균공정의 효율성에 문제 - 미생물의 특성에 대한 정보부족 - 우유의 경우 부적절한 살균처리공정이 일반적 원인 -> 원유음용자 : 살균우유 음용자에 비해 Salmonella dublin 에 의한 질병발병확율 158배 높음 (2) 우유내의 병원성 미생물 - 미생물 성장을 위한 우유의 특징 : 다양한 영양소, neutral pH -> 훌륭한 성장배지조건 - 질병발현 변화 초기 : 결핵, diphtheria, scarlet fever 결핵진단용 시약 개발 질병예방 프로그램 살균에 대한 강제규정 적용 발생건수 급격 감소 - 다른 질병 발현

5. 원유의 미생물 5 우유의 병원성세균 5. 우유에 존재하는 병원성균의 특성 < Listeria monocytogenes> (1) 균의 특성과 유래 - 1926 guinea pig 에서 분리 - 사람, 동물에게 Listeriosis 유발 (circling disease, 선회병, 선회, 장애물에 대한 돌진) - gram+, no spore, rod shape - optimal temp : 30~37oC - trypticase soy agar 에서 청록색 colony 형성 - 혈액함유배지에서 ß-용혈성(투명 용혈환) - optimal pH : 4.8~9.6 -> pH 5.5 이하에서 생육저해 - catalase + (2H2O2 --> 2H2O + O2) - 자연계에 널리 분포 : 토양, 활엽채소류, 생육, 가금류 - 유방염유, 원유, 발효불량 silage - 사람의 발병증세 : 유산, 면역체계이상, 수막염, 정신박약증세 유발, 미숙아 패혈증 - 예방 - 열처리에 민감 : HTST(72oC, 15초)에서 사멸 - 1차 조치 : 우유의 오염방지 - 유가공공장의 위생상태 유지, 적절한 살균시스템 도입 - 잠재적 오염가능성 배제 - 양질의 silage 사용 - 적합한 소독제 사용 - 정기적 가축상태 점검(유방, 유두, 유방염)

5. 원유의 미생물 5 우유의 병원성세균 < Listeria monocytogenes> (2) 저장중의 생육  4oC one generation : 1.5일  Marth (1986) : 액상유제품 초기 ->세균수 103/ml at 4oC lag phase : 5days 2 week after -> 106/ml 3-4 week after -> 108~109/ml(초콜릿 우유) 107/ml (일반우유)  치즈 탈지분유에서도 장기간 생육 - 염분농도 영향  5% salt conc. -> 5oC 에서 70일간 생육  25.5% -> 37oC : 5 days 22oC : 32 days 생존 4oC : 132 days - 열사멸온도  60oC -> 30 min  71.7oC -> D value : 0.9 초, Z-value : 6.3oC

5. 원유의 미생물 5 우유의 병원성세균 < Yersinia enterocolitica> - gram -, no spore, rod shape - 내냉성 -> 생육온도범위 : 0~45oC, 적온 : 22~29oC - 알칼리성 환경에서 견딤 -> 균주 선발에 이용 - Yersinia selective agar -> 흑점, 표적집락형성 - 자연계에 널리 분포(동물성 식품, 호수, 시냇물, 분변, 오줌, 곤충) - 위장염, 장간막 임파선증, 말초회장염 - 사람에게 비병원성(원유, 살균유에서 검출되기는 함) - 열처리에 불안정 < Campylobacter jejuni> - gram -, no spore, S-shape - 나사모양운동성 - 자연계에서 호기성 -> 산소부족시에도 성장 : facultative aerobe - 성장 : 30~47oC, 적정 : 42oC - ß-용혈성, catalase+ - 젖소 유방염의 원인균 -> 원유에서도 분리 - 동물, 설치류의 분변에서 분리 - 만성장염, 급성 대장염증 수반 –빈번하게 발생 - 1~10세유아 : 장염감염증 발생 - 열처리, 건조, acidic pH에 민감

5. 원유의 미생물 5 우유의 병원성세균 < 병원성 대장균 E. coli> - gram -, no spore, rod shape - 미생물 오염가능성 지표 - 적온 : 37oC - 가스발생대사 -> 우유 위생검사에 이용 glucose lactate, acetate, formate formic acid CO2 + H2 formic DHG - 5 groups  EPEC : entero pathogenic E. coli (장관 병원성)  ETEC : “ toxigenic (장관독소 생성)  EIEC : “ invasive (장관침해성)  EHEC : “ hemorrhagic (장관출혈성)  EAggEC : “ aggregative (장관응집성) - 사람, 동물의 장내 정상균총으로 상존 - 설사, 방광염의 원인균 -> 음식물 및 식수에 의한 설사 ->장독소 생성과 관련 * 장독소 -> LT : heat-labile enterotoxin ST : heat-stable VT : verotoxin - E. coli O157:H7 - EHEC group - 출혈성 대장염, 용혈성 요독증 - 쇠고기에서 종종발견, 열에 약함

5. 원유의 미생물 6. 원유의 위생적 품질 6. 한국 원유의 위생적 품질 1) 원유의 위생적 품질 - 영양적 측면 : 지방, 단백질, 탄수화물, 비타민, 무기물 -> 함량, 균형 중요 - 위생적 측면 : 세균수, 체세포수, 세균발육억제물질 잔류여부 -> 관심도 상승 - 세균숫자 : 환경위생, 원유관리상태 표시지표 - 체세포수 : 젖샘조직의 건강상태 표시 -> 유방염유 혼입판정 1993. 6 -> 유질등급제 시행 2) 한국원유의 위생적 품질향상 - 일반세균수 크게 감소 -> 냉각기 보급, Tankrory 집유, 품질향상노력(세균수에 의한 유질등급제) - 체세포수 : 큰 차이없음 -> 원유중 수의 증가 -> 유방염증, 생리적 이상 징후 -> 한국젖소의 50% 이상 -> 잠재형 or 임상형 유방염 증세 -> 50만/ml 이상 -> 유방염증상으로 판단 -> 영향 -> 유량감소 : 8% 유당감소 : 5-20% 무지고형분 감소 : 8% 유지방 감소 : 5-12% 단백질 감소 : 6-18% - 유질개선 방안 -> 위생적 지도관리 강화 -> HACCP system 가동 (Hazard Analysis Critical Control Point) : 위해요소 중점관리 -> TQC(total quality control) 가동

월별 SPC 및 Coli form 세균의 년도별 변화

5. 원유의 미생물 6. 원유의 위생적 품질 3) 원유의 위생적 품질검사법 (1) 세균수 - SPC(standard plate count) - 기계를 이용한 방법 : Bactoscan, Bactometer, Malthus

5. 원유의 미생물 6. 원유의 위생적 품질 3) 원유의 위생적 품질검사법 (2) 체세포 - 몸을 구성하는 각 기관조직세포 - 유방의 유선세포 -> 우유중에 포함 - 건강한 젖소 -> 20만 이하/ml (60%:상피세포, 40%:백혈구) 체세포 증가 -> 50만이상/ml(유방염) 백혈구함량 및 비율 증가 호중구 90% 이상으로 증가 - 체세포 염색 및 검사법 1. 직접현미경법 -> newman-lampert staining 후 핵을 가진 모든 세포 count 2. Hemacytometer 법 -> tryphan blue 염색 후 염색된 체세포 count 3. 기계를 이용한 자동 측정법 - Fossomatic -> 체세포의 DNA를 형광물질로 염색 후 일정시간동안 발광되는 세포수 측정 flow cytometer 원리 이용 - Somacount (3) 세균억제물질 - 항생물질 : 미생물배양에서 추출 - 합성항균제 : 인공적으로 합성 - 역가 : 미생물의 생육억제정도 표시 MIC : minimal inhibition concentration, 최소발육억제농도 unit : penicillin ppm : mg/L, mg/Kg ppb : μg/L, μg/Kg

5. 원유의 미생물 6. 원유의 위생적 품질 우유의 항생제 검사 법(존재유무판단) - TTC 색소 환원법이 많이 이용 (triphenyl tetrazolium chloride) TTC reduced TTC(붉은 색) 우유의 세균 증식 우유의 산화환원전위 낮춤 항생물질 Oxi-TTC Red-TTC (red) - 인위적으로 세균을 증식시켜 항생물질 존재 여부 밝힘 - 항생제에 대한 민감도가 중요 - TTC-I : Streptococccus thermophilus C-510 균주 이용 - TTC-II : Bacillus megaterium 균주 이용 우유의 항생물질 잔류량 검사 (정량 검사) - MIC 측정 -> paper disk 이용 억제환의 크기 측정 -> 농도와 억제환의 상관계수에서 농도 계산 - 각 항생물질에 대한 검정용균주가 다름 -> sensitive 한 균주 이용 penicillin G -> Micrococcus Iuteus ATCC 9341 Streptomycin -> Bacillus subtilis ATCC 6633 - 검사방법에 따른 주요 세균억제물질 검출 한계 -> 표 3-20 - 검사방법별 특성비교 -> 표 3-21