Mammalian cell culture Ⅱ
01 실험 목적 Cell counting 세포의 수를 대략적으로 계산하여 실험에 이용하는 방법을 숙지하고 직접 실험하면서 주의할 점을 알아본다.
02 Introduction Cell counting 세포를 실험에 이용하기 위해서는 알맞은 세포 양을 일정한 양으로 plate에 분주하는 것이 중요하기 때문에 cell counting을 통해 정확한 세포 수를 파악한다. ● Hemocytometer ● Cell Counter
02 Introduction Hemocytometer 𝐴+𝐵+𝐶+𝐷 4 x 2 x 10 4 (cells/ml) Cell counting 02 Introduction Hemocytometer Trypan blue staining 𝐴+𝐵+𝐶+𝐷 4 x 2 x 10 4 (cells/ml) x dilution factor(ml) Total cells(cells)
Cell counting 02 Introduction Cell Counter
Cell counting 03 Materials & Methods 1. 기존의 배지를 제거하고 PBS 4 ml을 조심스럽게 넣고 가볍게 흔들어준다 2. PBS를 제거한 후 Trypsin-EDTA 0.5 ml을 넣고 2분간 incubation 3. 배지 4 ml을 더한 후 cell을 모아15 ml tube로 옮긴다 4. Room Temperature, 1000 rpm에서 2분간 centrifuge 5. Cell pellet을 제외한 상층액을 제거하고 새로운 배지 5 ml을 넣어 재혼탁한다 6. e-tube에 세포 10ul + Trypan blue 10 ul 를 섞어서 10 ul를 Hemocytomete에 분주한다 7. 현미경을 통해 Trypan blue로 염색되지 않은 cell(흰색)만 countin한다. 8. Total cells을 구하고 원하는 세포 수를 계산 할 수 있다 Clean bench, 배양할 세포, 배지, 6cm dish, PBS, Trypsin-EDTA, Water bath, Pipette, Tip, 15 ml tube, Incubator, Centrifuge, Trypan blue, Hemocytometer
Cell counting 03 Materials & Methods 1. 기존의 배지를 제거하고 PBS 4 ml을 조심스럽게 넣고 가볍게 흔들어준다 2. PBS를 제거한 후 Trypsin-EDTA 0.5 ml을 넣고 2분간 incubation 3. 배지 4 ml을 더한 후 cell을 모아15 ml tube로 옮긴다 4. Room Temperature, 1000 rpm에서 2분간 centrifuge 5. Cell pellet을 제외한 상층액을 제거하고 새로운 배지 5 ml을 넣어 재혼탁한다 6. e-tube에 세포 20ul + Trypan blue 20 ul 를 섞어서 20 ul를 slide 에 분주한다 7. Cell counter에 slide를 넣고 측정한다 8. Total cells을 구하고 원하는 세포 수를 계산 할 수 있다 Clean bench, 배양할 세포, 배지, 6cm dish, PBS, Trypsin-EDTA, Water bath, Pipette, Tip, 15 ml tube, Incubator, Centrifuge, Trypan blue, Cell counter
Counting(A+B+C+D)한 세포 수 와 Total cell의 수 Cell counting 04 Result Counting(A+B+C+D)한 세포 수 와 Total cell의 수
05 Discussion Q1. Trypan blue staining 원리 Cell counting 05 Discussion Q1. Trypan blue staining 원리 Q2. (A+B+C+D)가 400일 때 3*105cells를 얻기 위해 몇 ml이 필요한지 구하시오 (trypan blue staining O) Q3. Hemocytometer 계산법 중 104 를 곱해주는 이유는? 𝐴+𝐵+𝐶+𝐷 4 x 1 2 x 10 4 (cells/ml) 2주차+3주차 report -> 3월 23일 수업시간 제출
310호 507호 3:20 – 3:50 8조 3조 3:50 – 4:20 6조 2조 4:20 – 4:50 4조 1조