미생물의 유전 2 MICROBIAL GENETICS http://bioenv.sunchon.ac.kr

진화 (Evolution)와 변이(Variation) 진화와 변이의 원인 . 돌연변이 (Mutation) . 유전자 재조합 (Genetic recombination) http://home.sunchon.ac.kr/~bioenv/

돌연변이(Mutation) 돌연변이(mutation) 돌연변이의 중요성 - 세포간에 유전자의 교환 없음 (유전자 재조합이 일어나지 않음) - 한 세포내의 유전정보의 변화 (DNA 염기서열의 변화) - 형질변화가 자손에게 전달 돌연변이의 중요성 - 진화(evolution)의 동력 - 균주 개량(strain development) - 암의 원인(carcinogenesis) * 미생물의 돌연변이를 이용한 발암물질(항암물질)의 검색

돌연변이의 기작 돌연변이의 기작 - 부정확한 복제 DNA 손상 - DNA 수리 완전한 수리(error-free repair) 원래 염기서열의 회복 – 돌연변이 일어나지 않음 불완전한 수리(error-prone repair) 염기서열의 변화 – 돌연변이 또는 치사 - DNA 염기서열 변화 ⇒ 단백질 아미노산 서열 변화 ⇒ 단백질의 기능(예: 효소의 활성) 변화 ⇒ 세포의 형질변화

용어(terminology) 자연돌연변이(spontaneous mutation) 인공돌연변이(artificial mutation, induced mutation) 돌연변이(mutation) 돌연변이 균주(mutant) vs. 야생형 균주(wild type) 돌연변이원(mutagen) 돌연변이 생성(mutagenesis) 임의 돌연변이(random mutagenesis) 위치특이 돌연변이(site-directed mutagenesis)

DNA 염기서열의 변화 야생형 : -A-B-C-D-E-F-G- 돌연변이형 염기치환 : ⇨ -A-B-C-X-E-F-G- 염기첨가 : ⇨ -A-B-C-X-D-E-F-G- 염기결손 : ⇨ -A-B-C-E-F-G- 중 복 : ⇨ -A-B-C-A-B-C-D-E-F-G- 전 좌 : ⇨ -A-B-C-L-M-N-D-E-F-G- 역 위 : ⇨ -A-B-C-E-D-F-G-

점돌연변이 (point mutation) = 염기치환 (base substitution) 틀밀림돌연변이 (frameshift mutation) 염기첨가(base addition) 염기결손(base deletion) 염기치환 (base substitution) 첨가 (addition) 결손 (deletion) 중복 (duplication) 전좌 (translocation) 역위 (inversion)

염기치환의 결과

Missense mutation Nonsense mutation Silent mutation - 염기치환의 결과 다른 아미노산에 대응하는 유전암호를 갖게 됨 - 원래 단백질과 아미노산 서열이 다른 단백질 합성 Nonsense mutation - 어느 아미노산에도 대응하지 않는 유전암호를 갖게 됨 - nonsense codon(stop codon) : UAA, UAG, UGA - 단백질 합성 정지, 원래보다 짧은 단백질이 만들어짐 Silent mutation - 유전자의 염기서열을 변했으나 (유전형, genotype) 단백질의 아미노산 서열은 변하지 않음 (표현형, phenotype) - 코돈의 퇴행성(codon degeneracy): 한 아미노산에 대응하는 triplet codon이 여러 개인 현상

틀밀림 돌연변이의 결과

치사돌연변이 (lethal mutation) 복귀돌연변이 (back mutation, reversion) - 야생형 –(돌연변이)-> 돌연변이주 –(돌연변이)-> 야생형 - 점돌연변이 : 복귀돌연변이가 비교적 쉽게 일어남 틀밀림 돌연변이 : 복귀돌연변이가 일어나기 어려움

돌연변이원(mutagen) 자연돌연변이 인공돌연변이 낮은 돌연변이의 빈도 (mutation rate, mutation frequency) 인공돌연변이 돌연변이 유도물질을 이용하여 돌연변이의 빈도를 높임 Mutagen (mutagenic agent, 돌연변이 유도제, 돌연변이 유발물질) 화학물질(chemical mutagens) 물리적 처리(physical mutagens) 생물학적 돌연변이 유도제 (biological mutagen)

Chemical mutagens - 염기 유사물질 (base analog) : 5-bromouracil (5-BU), 2-aminopurine (2-AP) - 염기와 화학반응을 일으키는 물질 (chemicals reacting with DNA) nitrous acid(HNO2, 아질산), hydroxylamine(NH2OH) - 알킬화제 (alkylating agent) nitrosoguanidine(NTG), methylmethane sulfonate(MMS) - Intercalating agent acridine orange, ethidium bromide

- 전이성 인자(이동 유전물질, transposable element) Physical mutagens - Nonionizing radiation (비이온화 방사선) ultraviolet ray(UV) : 260nm - Ionizing radiation (이온화 방사선) : free radical 형성 X-ray, cosmic ray, gamma ray Biological mutagen - 전이성 인자(이동 유전물질, transposable element) insertion sequence(IS), transposon(Tn), bacteriophage Mu * jumping genes

유전자 재조합(Genetic recombination) 유전자 재조합 (in vivo genetic recombination) - 두 세포의 유전물질이 하나로 통합되어 새로운 유전자 조성을 가진 세포가 형성되는 과정 - 양친 세포들의 유전정보가 혼합된 새로운 형질을 가진 딸세포가 만들어짐 - 자연계에서 유전자 재조합에 의한 유전정보의 교환은 같은 염색체 구성을 가진 같은 종의 생물체 간에만 일어남 in vivo genetic recombination sexual reproduction(유성생식), … in vitro genetic recombination 원형질체 융합 (protoplast fusion), 유전자 조작 (gene manipulation)

진핵생물의 유전자 재조합 감수분열에 의한 생식세포 형성 ⇒ 생식세포의 융합(수정)/염색체 재조합 ⇒ 양친과 다른 형질을 가진 자손

진핵 미생물의 유전자 재조합 진핵미생물 진균의 유전자 재조합 - 생활환의 일부에서 유성생식 - 유성생식 (sexual reproduction) 감수분열에 의해 생식세포 형성 – 반수체 (n) 생식세포가 접합하여 접합체(zygote) 형성 – 배수체(2n) 유성포자 형성 - 준유성생식 (parasexual reproduction) 감수분열이 일어나지 않음(생식세포의 형성 없음) 균사의 접합에 의한 유전자 재조합 유성포자가 형성되지 않음 불완전균류의 중요한 유전자 교환 수단

원핵미생물의 유전자 전달 원핵미생물 - 모든 유전체가 참여하는 진정한 접합체 형성에 의한 유전자 재조합은 일어나지 않음 - 부분적인 접합체(merozygote) 형성 공여세포(donor cell)의 유전물질 일부가 수용세포(recipient cell)에 전달되어 염색체 교차(crossing over)에 의해 부분적인 유전자 재조합 - 유전자 전달(genetic transfer)

염색체 교차에 의한 유전자 재조합

세균의 유전자 재조합(전달) 방법 형질전환 (transformation) 접합 (conjugation) - 공여세포에서 DNA가 추출 또는 방출됨 (naked DNA) 추출 또는 방출된 DNA를 수용세포가 받아들임 접합 (conjugation) - 공여세포와 수용세포가 직접 접촉 (성선모를 통하여) 공여세포의 유전물질의 일부가 수용세포에 전달됨 형질도입 (transduction) - 공여세포의 유전물질의 일부가 파지를 매개체로 하여 수용세포에 전달됨

형질전환(Transformation) http://home.sunchon.ac.kr/~bioenv/

형질전환 능력 (competence, competency) - 자연에서는 일부의 세균들이 특정한 생리적 조건에서만 형질전환을 일으킴 (naturally competent) (수용능 인자, competence factor) - 대장균은 자연상태에서 형질전환 능력이 없음 CaCl2와 heat shock(42℃) 처리하면 형질전환 능력 획득 (artificially induced competence, competent cell) - 선형 DNA에 비해 plasmid의 형질전환 효율이 매우 높음 ☞ 유전자 조작시 외래 유전자를 도입하는 중요한 수단 Plasmid를 유전자 운반체(cloning vector)로 사용

접합(Conjugation, Mating) F- plasmid (sex plasmid) F : fertility a conjugative plasmid F+ cell - F plasmid를 가진 세포 - 성선모(F-pilus, sex pilus) - 성선모는 접합다리 역할 (conjugation bridge) - 접합시 공여세포 F- cell - 접합시 수용세포

F+ x F- mating - 성선모(접합다리)를 통해 공여세포와 수용세포가 직접 접촉 - 공여세포의 F-plasmid가 전달복제(transfer replication) - 복제된 F-plasmid가 접합다리를 통해 수용세포에 전달 - 전달된 1가닥 F-plasmid에 상보적인 가닥 합성 - F-plasmid를 전달받은 수용세포(F- cell)는 F+ cell이 됨 http://home.sunchon.ac.kr/~bioenv/

Hfr cell의 형성 - F plasmid는 F+ cell 염색체의 일부로 존재할 수 있음 (episome) - Hfr (High frequency recombination) cell : 고빈도재조합 균주 F plasmid가 염색체의 일부로 존재하는 세포 http://home.sunchon.ac.kr/~bioenv/

Hfr x F- mating - Hfr cell : 염색체에 삽입된 F factor의 중간 부분에서 전달복제가 시작됨 수용세포에 전달됨 - 전달된 공여세포 염색체 부분과 수용세포 염색체가 재조합

Hfr x F- mating의 결과 - 공여세포 유래 염색체의 일부가 수용세포 염색체의 일부가 됨 - 높은 빈도로 공여세포와 수용세포 유전자의 재조합이 일어남 (High frequency recombination) - Hfr의 염색체 + F factor 전부가 전달되기는 일은 매우 어려움 ☞ 수용세포는 공여세포의 일부 유전자를 받아들이나 F+ cell로 전환되지는 않음(F- cell로 남아 있음) - F+ x F- mating에서는 F plamid만 전달될 뿐 공여세포 유전자는 수용세포에 전달되지 않음

F’ x F- mating F’ plasmid F’ x F- mating의 결과 Hfr cell의 염색체에서 염색체의 일부와 함께 분리됨 F’ x F- mating의 결과 . F- cell은 F+ cell로 전환됨 고빈도로 재조합이 일어남 . F- cell은 공여세포의 염색체 일부를 가진 F+ cell로 전환됨

형질도입(Transduction) 형질도입 (Transduction) - 공여세포의 유전물질이 파지를 매개체로 하여 수용세포에 전달되는 현상 - 파지가 조립•포장될 때 실수로 공여세포 유전물질의 일부가 포함됨 - 파지가 수용세포를 감염시킬 때 공여세포의 유전물질이 수용세포에 전달됨 - 일반형질도입 (generalized transduction) 특수형질도입 (specialized transduction) http://home.sunchon.ac.kr/~bioenv/

파지의 용균성•용원성 생활환

일반형질도입(Generalized transduction) 병원성 파지 또는 잠재성 파지의 용균성 생활환에서 일어남 용균 과정에서 세균의 염색체가 단편이 파지 입자에 들어감 공여세포의 염색체 일부를 포함한 파지 입자가 수용세포를 감염시킬 때 일어남 공여세포의 어떤 유전자라도 수용세포에 전달될 수 있음

특수형질도입(Specialized transduction) 잠재성 파지에서만 일어남 잠재성 파지의 유전물질은 숙주세포 염색체의 특정 부위에 삽입됨 프로파지가 유도되어 숙주세포 염색체로 부터 분리될 때 인접 부위의 숙주세포 유전자와 함께 분리됨 파지가 수용세균 염색체의 특정 부위에 삽입되면 유전자 재조합이 일어남 파지의 삽입위치에 인접한 특정한 유전자만이 전달될 수 있음 예) λ파지 : gal, bio

λ 파지에 의한 특수형질도입 : gal 의 전달

항생제 저항성

유전공학 (Genetic Engineering) 다른 생물체의 유전자 또는 인공적으로 합성한 유전자를 숙주세포에 도입 새로운 형질을 가진 생물체 (형질전환 생물체)를 만듦 유전공학 (Genetic engineering) 유전자 조작 (Gene manipulation) 유전자 클로닝 (Gene cloning) 재조합 DNA 기술 (Recombinant DNA technology) 생명공학 (Biotechnology) GMO (Genetically Modified Organism) GEM (Genetically Engineered Microorganism) LMO (Living Modified Organism)

제한효소 (Restriction Enzyme) 제한-수식계 (Restriction-Modification System) 제한효소 (Restriction endonuclease) . 이중가닥 DNA의 특정한 염기서열을 인식하여 절단 회문성 인식서열 (palindromic recognition sequence) . 제한효소의 명명 EcoRI : Escherichia coli RY13 BamHI : Bacillus amyloliquefaciens HindIII : Haemophilus influenzae SalI : Streptomyces albus

제한효소의 인식서열 (Recognition sequence) - 회문성 서열 (palindromic sequence) EcoRI : GAATTC BamHI : GGATCC HindIII : AAGCTT HaeIII : GGCC Sau3A : GATC

접착성 말단/비접착성 말단 (sticky end, blunt end)

접착성 말단 or 비접착성 말단? EcoRI : G/AATTC BamHI : G/GATCC HindIII : A/AGCTT HaeIII : GG/CC SmaI : CCC/GGG Sau3A : /GATC

재조합 DNA (recombinant DNA) Recombinant DNA, Chimeric DNA (chimera), Hybrid DNA

유전자 운반체 (Cloning vector) . 외래 DNA는 운반체에 삽입하여 숙주세포에 도입 . 운반체는 복제개시점 (ori, origin of replication)을 가지고 있어 숙주세포 내에서 (삽입된 외래 유전자와 함께) 독립적으로 복제됨 . 플라스미드 운반체 파아지 운반체 Cosmid 운반체 인조염색체

유전자 cloning의 기본 과정 1. DNA 분리와 정제 : 유전자원, 운반체 2. DNA 절단 : 제한효소 3. DNA 단편과 운반체 연결 : DNA 연결효소 (DNA ligase) 4. 숙주세포에 재조합 DNA 도입 : 형질전환(transformation) 5. 형질전환 균주 선발 : 운반체의 선발표지 이용 6. 원하는 형질전환 균주 선발 : DNA, mRNA, Protein, Function

Humulin (Human insulin) 생산

유전공학은 무엇을 할 수 있나? We need your IMAGINATION

선악은 우리가 그것을 어떻게 사용하느냐에 따라 결정된다. 유전공학 기술을 이용하기 전에! 기술 그 자체는 선하지도 악하지도 않다. 선악은 우리가 그것을 어떻게 사용하느냐에 따라 결정된다.