PCR mediated mutagenesis 생화학 실험 II 담당 조교 : 이연, 김윤미

Polymerase Chain Reaction DNA의 특정 부분을 반복 합성함으로써 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭 및 복제하여 대량으로 얻는 기술이다. DNA의 증폭 시간이 짧고 특정 DNA의 COPY수를 기하급수적으로 증폭시켜 많은 양의 DNA를 얻을 수 있다.

Polymerase Chain Reaction PCR 구성요소 a. DNA template - 특정 DNA부분을 포함한 증폭 대상 b. Primers - 20~30bp정도의 짧은 염기서열. -주형가닥의 자신과 상보적인 염기서열에 결합을 형성한다. - Primer의 염기서열과 농도는 전체 반응의 성패에 가장 큰 영향을 미치는 요인중 하나이다. c. DNA polymerase(중합효소) - 강한 열 안정성을 가진 유전자 합성효소 d. dNTP (deoxy-nucleotide) - 구성: dATP, dTTP, dCTP, dGTP 유전자를 합성하는 재료가 되는 각 nucleotide 염기들 e. 기타 PCR buffer, Distilled water

Polymerase Chain Reaction The three steps of PCR Step 1. Denaturation :열을 가하면 DNA의 이중가닥의 수소결합이 파괴되어 단일가닥으로 분리됩니다. Step 2. Annealing : DNA primer가 DNA 에 결합하는 단계. Step 3. Extension : DNA polymerase 에 의해 DNA 합성이 일어나는 단계. (유의사항 : Extension time의 설정은 증폭하고자 하는 product의 size와 사용하는 효소에 따라 달라진다.) Herculase II: ~1kb(30s) Taq polymerase: ~1kb (1min) (25~30cycle)

Polymerase Chain Reaction DNA분자는 첫번째 주기부터 2n 으로 증폭한다. 표적 DNA분자는 세번째 주기부터 합성되며 2n-2n으로 증폭한다.

Overlap-extension PCR OE-PCR은 PCR 방법을 이용하여 단백질 분자 내의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 여러 방법 중 하나이다. 단백질 내의 특정 아미노산만을 다른 아미노산으로 변경하기 위해서는 치환 아미노산에 해당되는 DNA 염기서열을 유전자상에서 쉽게 치환할 수 있도록 해야 한다. 치환하고자 하는 DNA 염기서열을 변형시키기 위해서 OE-PCR에서는 4개의 서로 다른 primer들을 사용하여 두 번의 연속적인 PCR을 수행해야 한다 PCR-mediated INSERTION mutagenesis PCR-mediated DELETION mutagenesis Lee, J et al. BioTechniques 36, 398-400 (2004)

PCR-mediated DELETION mutagenesis Step1. Primer a와 b를 이용하여 왼편 유전자를 증폭시키고, primer c와 d를 이용하여 오른쪽 유전자를 증폭시킨다. Step2.위의 두 product를 가열한 후 혼합시키면,primer b와 c는 서로 중첩될 수 있는 서열을 가지고 있으므로 두 유전자 사이에서 혼성화가 일어난다.a와 d를 사용하여 유전자를 증폭시키면 chimeric 유전자를 얻을 수 있다.

PCR mediated mutagenesis 5’ 3’

Primer design 시 주의사항 1) 길이는 20~30bp로 제한한다. → 너무 짧으면 결합력이 약하고 너무 길면 시간과 효율면에서 좋지 않음 2) G+C%가 50~60%로 구성되어야 하며 purine과 pyrimidine 염기의 연속적인 배열은 피해야 한다. 3) 한 쌍의 primer가 부분적으로 서로 상보적이지 말아야 한다. → primer-primer dimer의 형성 가능성을 배제하기 위함

Primer design 시 주의사항 4) Primer의 3’말단에 G or C 가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 한다. → 5’말단 sequence는 annealing에 크게 중요한 역할을 하지 않지만 3’말단 sequence는 PCR product가 extension하는 부위이기 때문에 PCR의 sensitivity와 specificity에 중요한 역할을 함. 3개 이상의 G or C는 비특이적인 증폭을 야기하므로 피하는 것이 좋음 5) Primer의 3’말단에 T가 오지 않도록 한다. → Thymine은 올바르지 못한 다른 염기와 misparing할 가능성이 높음 6) Tm값이 동일한 두 primer 설계 (또는 차이가 5℃이하 까지 설계) - Tm value = [4*(G+C) + 2*(A+T)] * annealing temp. = Tm – 3℃ (or 5℃)

Procedure : Primary PCR Ingredient for PCR reaction (Primary PCR) Primary PCR condition Component Quantity per reaction Targets 1-10kb Distilled water 35.5ul 5x Herculase II reaction buffer 10ul dNTP mix 0.5ul DNA template 1ul Primer A,B /C,D Each 1ul/tube Herculase II fusion DNA polymerase Total reaction volume 50ul Temp.(℃) Time 95 5min 30sec 55 72 30 cycles

Gel electrophoresis result

Report 제출기한 : 화요일(10/13) 오후 3시까지 > 늦게 제출 시 태도점수 감점 제출기한 : 화요일(10/13) 오후 3시까지 > 늦게 제출 시 태도점수 감점 제출장소 : S401호 (세포주기 연구실) Hand-writing 미 제출 시 0점 처리 인터넷의 자료를 그대로 이용 시 감점처리 기타 문의 사항은 이연 (liyan900506@hotmail.com)

Discussion Homework Gel Data 붙이고, 그 결과에 대해 분석할 것. PCR에서 유전자가 증폭되는 과정을 3cycle까지 그려볼 것. Primer design시 주의사항에 대해 설명할 것. PCR-mediated deletion mutagenesis의 과정을 설명할 것. Homework