제11장 유전공학 11.1 DNA 변형과 조작을 위한 분자적 도구들 일반화된 유전암호 해독 방식을 통해, 어떤 생명체로부터 유래된 하나의 유전자는 다른 생명체에서도 똑같은 방식으로 해석됨 개구리의 유전자를 식물세포에 넣어주면, 식물세포는 개구리가 만드는 것과 똑같은 방식으로 개구리의 단백질을 만듦 (1) 유전자를 자르고 붙이기 위해서 제한효소와 연결효소가 이용된다 제한효소(restriction enzyme) = 제한 핵산분해효소(restriction endonulcease) - 벅(Paul Berg)에 의해 발견된 박테리아로 침투한 바이러스 DNA를 파괴하는 일 군의 박테리아 효소 - DNA 가닥에서 특이적인 염기서열 부분을 절단하고 바이러스의 증식을 제한한 다는 것을 발견하고 이를 제한효소로 명명(그림 11.1)

- DNA 뼈대에 남아 있는 틈(nick)을 메워주는 효소 - 제한효소가 인식하는 염기서열은 일반적으로 역상보성 염기서열 (palindrome) 구조를 하고 있음(그림 11.1) - 제한효소는 자신이 인식하는 염가서열이 없으면 그 DNA를 자르지 않음  박테리아는 자신의 DNA를 화학적으로 변형시킴으로써, 자신의 유전 자는 해를 입지 않고 바이러스 DNA만 파괴시킬 수 있음 - 점착성 말단(sticky end): 제한효소에 의해 잘린 부위가 단일가닥 부위를 가지고 있어 다른 DNA 조각들과 수소결합을 하여 이중가닥을 형성하는 부위(그림 11.1) DNA 연결효소(ligase) - DNA 뼈대에 남아 있는 틈(nick)을 메워주는 효소

그림 11. 1 DNA 재조합. 제한효소는 DNA의 특정한 염기서열 부위를 자름으로써 󰡐점착성 말단󰡑을 형성한다 그림 11.1 DNA 재조합. 제한효소는 DNA의 특정한 염기서열 부위를 자름으로써 󰡐점착성 말단󰡑을 형성한다. (A) EcoRI 효소는 GAATTC 염기서열의 G와 A 사이를 자른다. (B) 이렇게 엇갈리게 자른 모양은 AATT 염기서열로 이루어진 ‘점착성 말단’을 이룬다. (C) 서로 다른 두 종류의 DNA를 같은 제한효소로 자른 다음, 그 조작들을 서로 연결하여 재조합 DNA를 만든다.

(3) 벡터는 클로닝과 유전자 발현을 위한 분자적 도구이다 (2) 역전사효소는 mRNA로부터 DNA를 만든다 역전사효소(reverse transcriptase) - 단일가닥 RNA (single-strand RNA)를 유전체로 가지고 있는 바이러스인 레 트로바이러스(retrovirus)가 생산하는 특이적인 효소 - 단일가닥 RNA를 주형(template)으로 이용하여 정확하게 염기서열이 일치하 는 이중가닥 DNA를 합성함 - 진핵생물의 유전자를 다룰 경우, 인트론(intron)이 제거된 mRNA로부터 상보 적 DNA (cDNA, complementary DNA)를 만드는데 사용함 (3) 벡터는 클로닝과 유전자 발현을 위한 분자적 도구이다 벡터(vector) - 목적 DNA 조각을 세포 속에서 안정적으로 유지시키기 위해 사용하는 DNA 운 반체 - 플라스미드(plasmid)(그림 11.2): 단지 몇 개의 유전자와 자신을 복제할 때 사 용하는 신호 염기서열인 복제원점(origin of replication)을 가진 작은 원형 의 DNA 벡터

발현벡터(expression vector) 재조합 DNA (recombinant DNA) - 특정 제한효소로 잘려진 목적 DNA 단편과 같은 제한효소로 잘려진 플라스미드를 DNA 연결효소(ligase)로 연결하여 만들어진 DNA 분 자(그림 11.3) - 재조합 플라스미드가 숙주세포(host) 내로 들어가면, 수백 개로 복 제됨 발현벡터(expression vector) - 목적 유전자를 숙주세포에서 높게 발현(expression)시킬 수 있도록 적절한 위치에 강력한 프로모터(promoter)를 포함하는 벡터 프로모터(promoter) - 유전자 발현에서 전사(transcription)의 개시 및 효율을 조절해주는 조절 염기서열로, 일반적으로 유전자의 전사개시점 앞부분에 위치 함

그림 11. 2 플라스미드. 플라스미드는 몇몇 생명체의 세포에서 자연적으로 존재하는 작은 원형의 DNA 분자이다 그림 11.2 플라스미드. 플라스미드는 몇몇 생명체의 세포에서 자연적으로 존재하는 작은 원형의 DNA 분자이다. 플라스미드는 그 속에 어떤 DNA가 포함되어 있더라도 염색체와는 독립적으로 복제될 수 있다. 이러한 이유로 플라스미드는 어떤 세포로부터 다른 종의 세포로 DNA를 실어 나르는 물체인 벡터로 이용하기에 매우 적합하다.

그림 11.3 재조합 DNA. 재조합 DNA 분자를 만들기 위해서는 플라스미드와 공여자 세포로부터 추출된 DNA를 같은 제한효소로 자른 다음 함께 섞는다. 이때 몇몇의 공여자 DNA 분자의 점착성 말단은 플라스미드의 점착성 말단과 수소결합을 하여 재조합 DNA 분자를 형성한다. 이런 재조합 플라스미드는 박테리아 속으로 들어가면 박테리아가 분열할 때마다 대량으로 복제된다.

11.2 중합효소 연쇄반응(PCR)과 DNA 증폭 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 1983년 북부 캘리포니아의 시터스 주식회사(Cetus Corporation) 직원인 뮬리 스가 고안한 유전자를 단시간에 수백만배로 증폭시키는 방법 (1) PCR은 매우 빠른 복제주기를 반복하여 DNA 를 중폭한다 PCR은 원하는 DNA 서열을 시험관 속에서 매우 빠르게 복제함(그림 11.4) PCR을 위하여 필요한 것들 - (1) 특정 개체로부터 추출된 극미량의 DNA - (2) 증폭을 원하는 표적 DNA에 대한 부분적인 염기서열 정보 - (3) 표적 염기서열 부위의 양끝을 인식하는 두 종류의 프라이머 - (4) DNA의 구성성분인 네 종류의 뉴클레오티드(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - (5) 내열성 세균인 Thermus aquaticus 유래의 DNA 중합효소인 Taq DNA polymerase

프라이머(primer): DNA 중합효소(DNA polymerase)가 복제를 시 PCR 반응 - 이들을 작은 튜브 속에 넣은 다음, 매우 빠르게 온도를 변화시켜주는 장비인 PCR 기계(Thermal cycler)에 넣음 - 열을 이용하여 표적 DNA의 두 가닥을 서로 분리 - 2개의 짧은 DNA 프라이머들이 분리된 표적 DNA 가닥에 상보적으로 결합할 수 있도록 온도를 낮춤 - Taq DNA polymerase가 잘 활동할 수 있는 온도로 맞춤 - DNA 중합효소는 프라이머에 염기를 첨가하여 표적 DNA 가닥과 상 보적 인 염기서열을 합성해 나감 - 이 반응을 반복하면 100만배 이상의 DNA 복제본을 얻을 수 있음 프라이머(primer): DNA 중합효소(DNA polymerase)가 복제를 시 작하기위해 필요한 주형가닥에 상보적인 짧은 염기서열을 가진 DNA 조각

그림 11.4 특정 DNA 서열의 증폭. PCR에서는 관심 있는 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 특정 프라이머들이 증폭하고자 하는 DNA 서열 부위를 표시해주는 경계 역할을 한다. 이러한 프라이머들과 DNA 중합효소 그리고 무수히 많은 뉴클레오티드들을 이용하여, 이 반응으로 표적 DNA 염기서열을 매우 빠르게 수백만 벌 복제할 수 있다.

(2) 매우 적은 양의 DNA를 이용해서도 PCR을 통해 원하는 부위만 증폭할 수 있다 PCR은 매우 적은 양의 DNA 또는 RNA를 대량으로 증폭하여 그것으로부터 의미있는 정보를 얻 을 수 있음 PCR의 활용범위(표 11.1) - 과학수사 - 유전적 상관관계 확인, 시신의 신분 확인, 범죄자의 범행 입증, 무고한 사람의 누명을 벗 겨주는데 활용 가능 - 농업, 수의학, 환경과학 및 인간의 건강에 관한 연구에 활용 가능

11.3 DNA의 분리 및 분석 (1) 젤 전기영동을 통해 서로 다른 크기의 DNA 조각들을 분리할 수 있다 전기영동(electrophoresis): 다양한 DNA 조각을 분석하기 위하여 음전하를 띤 DNA를 전기장에서 양극 쪽으로 움직이게 하여 DNA 조각의 이동 패턴을 비 교 분석하는 방법 (1) 젤 전기영동을 통해 서로 다른 크기의 DNA 조각들을 분리할 수 있다 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동: 반액체성(semiliquid) 매질인 아가로스 겔에 DNA를 이동시키면 겔의 작은 구멍들 사이로 작은 조각들이 큰 조각들보 다 더 빨리 이동하여 크기에 따라 구분 가능한 밴드의 형태로 나타남 (그림 11.5) 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide): DNA 조각들을 분리하는 데 사용하는 또 다른 매질로, 아가로스 젤과는 달리 염기 하나의 차이처럼 미세한 크기 차이 에 의한 DNA의 분리에 사용함

(2) DNA 지문법을 통해 개체의 정확한 식별이 가능하다 DNA 지문법(DNA fingerprinting, DNA profiling): 범죄수사에서 농작물의 교배에 이르기까지 널리 이용되는 개체의 정확한 식별법으로, 전체 유전 체를 분석하는 대신 유전체에서 변이가 매우 높은 특정 지역을 비교하는 방법임  일반적으로 단일염기변이 지역(단일염기다형)과 반복서열변이 지역을 비교함 단일염기다형(single nucleotide polymorphism, SNP): 집단 내에서 다형성 을 보이는 경향이 있는 단일염기부위  어떤 SNP가 제한효소에 의해 인 식되는 염기서열에 변이가 있을 경우, 해당 제한효소 처리 후에 DNA 조각 의 크기와 갯수가 달라짐(그림 11.5) 반복서열변이: 짧은 염기서열로 이루어진 특수한 반복염기서열의 갯수가 서로 다른 부위  예) 특정 염색체 상의 특정 부위에 ACT로 이루어진 반 복염기서열이 17번 반복되는 사람과 35번 반복되는 사람은 그 크기로 구 분이 가능함

그림 11.5 살인사건에서 DNA 조각 양상. (A) 서로 다른 DNA 시료를 같은 제한효소로 자를 경우 서로 다른 조각들의 양상이 나타난다. (B) 피고인의 옷에 뭍은 혈흔에서 채취된 DNA 조각 양상이 희생자의 DNA 양상과 일치하지만 피고인 자신의 DNA 양상과는 일치하지 않는다. 이것은 피고인의 옷에 묻은 혈흔이 피고인 자신의 것이 아니라 희생자의 것이라는 것을 증명하는 증거가 된다.

11.4 DNA 염기서열 분석 (1) 생어법을 통한 DNA 염기서열분석에서는 복제과정동안 작은 조각들이 생성된다 DNA 염기서열분석(DNA sequencing): 어떤 DNA 분자의 염기서열을 분석하는 기술 (1) 생어법을 통한 DNA 염기서열분석에서는 복제과정동안 작은 조각들이 생성된다 생어(Frederic Sanger)(그림 11.6) - 1977년에 DNA 염기서열을 결정하는 방법을 개발 - 실험 튜브 속에 분석대상 DNA를 넣은 다음, DNA 합성에 필요한 4종류의 뉴클레오티드(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)를 넣고 동시에 뉴클레오티드의 특정 부위를 화학적으로 변형시킨 다이 데옥시뉴클레오티드(dideoxynucleodtide)를 첨가 - DNA 중합효소가 다이데옥시뉴클레오티드를 만나면 새로 합성된 조각만 남겨두고 그 자리에 서 DNA 합성이 중단됨 (2) 이미 알려진 유전자들을 이용한 DNA 칩은 유전자분석을 간편하게 해준다 염기서열을 알고 있는 짧은 DNA 조각들을 DNA 마이크로칩(DNA microchip) 또는 DNA 마이크로어레이(DNA microarray)라고 하는 작은 유리판에 고정시킴(그림 11.7) 이런 칩들은 미지의 시료가 결합할 수 있도록 고안된 것임 서로 겹치는 부분을 연결하여 배열하면 전체 염기서열을 읽을 수 있음

그림 11.6 DNA 염기서열 결정. 생어법을 이용한 DNA 염기서열분석에서는, 알고자 하는 DNA와 상보적인 복제 가닥이 중간에 다이데옥시뉴클레오티드가 삽입됨에 따라 중도에 복제가 중단된다. 과학자들 또는 컴퓨터는 그 조각들을 크기 순서대로 배열함으로써 염기서열을 유추한다. 미세한 양의 각 조각들을 눈으로 확인하기 위해 방사능 표지를 한다.

그림 11.7 핵산혼성화를 이용한 염기서열분석. 작은 유리 마이크로칩 위에 고정되어 있고 이미 염기서열이 알려져 있는 짧은 DNA 조각들과 표지된 알고자 하는 DNA 조각의 염기들은 염기쌍을 이룬다. 염기 결합을 한 짧은 서열을 알아내고, 이것들을 서로 겹치게 배열하여 알고자 하는 DNA의 염기서열을 읽어낸다.

11.5 DNA 재조합 기술의 응용 (1) 형질전환기술은 어떤 생명체의 유전자들을 바꾼다 유전자는 모든 개체에서 동일한 방식으로 해독되기 때문에 사람이 필요한 단백질을 식물 혹은 세균이 만들게 할 수 있음 또한, 새로운 식품, 새로운 약물을 만들거나 기존 유전자의 문제점을 고치기 위해 특정 개체를 변형시킬 수 있음 (1) 형질전환기술은 어떤 생명체의 유전자들을 바꾼다 형질전환기술(transgenic technology)(그림 11.9) - 다세포 생물을 대상으로 하는 재조합 DNA 기술 - 관심 있는 유전자를 생식세포 또는 수정란 속으로 도입  세포가 성숙한 개체로 발생하게 되면 그 개체의 모든 세포는 외부유전자(transgene)를 가지게 됨  적 절한 조직에서 해당 유전자가 발현됨

세포에 외부 유전자를 도입시키는 기술(그림 11.8) - 1) 수용세포에 전기충격을 가하여 일시적인 구멍을 만들어 DNA 분자 를 도입 - 2) DNA를 직접 주사하거나 기구를 이용하여 쏘아서 도입 - 3) 지방성 소낭인 리포좀(liposome) 속에 DNA를 넣어서 도입 - 4) 감염성 바이러스에 DNA를 실어서 도입 형질전환 기술의 응용 - 생쥐에 인간의 유전자 도입  질병의 발생에 관한 연구가 가능하여 질병 초기단계 에서 치료가 가능한 치료제 개발이 가능 - 인간의 단백질을 동물의 젖 등에서 생산할 수 있음  미량으로 존재하는 인간 단 백질(혈액응고인자 등)들을 대량 생산 가능(그림 11.9) - 병충해 저항성 작물, 제초제 내성 작물, 베타카로틴을 생산하는 황금쌀, 생장호르 몬이 도입된 생장속도가 빠른 물고기 등

그림 11.8 세포에 DNA를 첨가하기. DNA는 그것 자체만으로 또는 바이러스나 리포좀 속에 포장된 상태로 세포 내로 주입될 수 있다.

그림 11.9 유전자 합성. 형질전환기술은 서로 다른 개체에서 유래된 유전자 조각들을 서로 합쳐서 유용한 물질을 만들어내는 새로운 유전자를 창조해낼 수 있다. 양, 연어 그리고 사람으로부터 유래된 유전자들을 서로 합쳐서 토끼의 수정란에 주입하여 뼈 질환 치료에 사용되는 칼시토닌을 분비하는 형질전환 토끼를 만들 수 있다. 인간의 α-락토글로불린 유전자는 이 치료약물이 토끼의 젖으로 분비될 수 있게 해준다.