세포생물학 및 실험 2 2018-2학기 생명과학과 박태식 교수님 화요일 (1-4 교시) Real time PCR (Q-PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR은 특정 DNA 조각을 증폭하는 방법으로서 현대 분자생물학의 가장 핵심적인 기술 중 하나이다. Denaturation (94-95℃) 이중 가닥인 DNA가 열에 의해 단일 가닥으로 풀어지는 과정 Primer Annealing (Tm-4℃) DNA 기질에 상보적인 primer가 결합하는 과정 Strand Extension (72℃) Annealing 단계에서 결합된 prime의 3’- OH에서부터 dNTP가 하나씩 첨가되며 DNA 합성이 이루어지는 과정

Polymerase Chain Reaction (PCR) 1 cycle PCR cycle 수를 n회라 가정했을 때 표적배열은 2^n 이다. Ex) 2 times(1 cycle), 4 times(2 cycles), 8 times(3 cycles), 16 times(4 cycles),,,,

RT(Reverse transcription) - PCR mRNA를 기질로 상보적으로 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용해 cDNA(complimentary DNA)를 합성하는 과정. 이러한 과정에서는 RNA와 primer의 annealing 위치에 따라 random hexamer, oligo d(T), 또는 증폭하고자 하는 유전자의 anti-sense primer 등이 이용된다. Random hexamer : mRNA의 모든 영역에서 cDNA 합성을 개시 Oligo d(T) : mRNA의 poly A tail에 annealing 되어, cDNA 합성을 개시 Anti-sense primer : 특정 mRNA 부위의 cDNA 만을 합성

Real-time PCR PCR 과정 중 실시간 증폭되는 산물의 양을 수치화 함으로써 샘플에 존재하는 기질의 초기량을 정확히 정량화 할 수 있는 가장 진보된 방법. 일반 PCR이 최종 증폭 후의 증폭산물만을 검출할 수 있는 반면 real-time PCR은 실시간으로 각 cycle에서의 PCR 산물을 정량 한다는 점이 다르다. ※ Plateau : PCR의 증폭산물의 양이 처음에는 cycle 수에 비례해서 대수적으로 증가하지만 증폭 산물의 양이 어느 한도를 넘으면 증폭 효율이 떨어지면서 최종적으로는 증폭하지 않게 되는 상태 증폭산물의 검출은 PCR 반응에 첨가하는 형광물질을 이용하고 있다. (ex. SYBR green, Taqman probe)

SYBR Green vs. TaqMan SYBR Green SYBR green (Interchelating 법) : SYBR green은 Double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(Interchelator)이다. Interchelator는 PCR 반응으로 합성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan probe법 : 5’ 말단은 형광물질(FAM 등)로 3’ 말단은 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 oligonucleotide(TaqMan probe)를 PCR 반응에 첨가하는 방법이다. TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridize 하지만, probe 상에 quencher에 의해 형광 발색이 억제된다. Extension 반응시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5’ -> 3’ exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 TaqMan probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. TaqMan

Real-time PCR 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. -Ct : 지정한 Threshold 값에 해당하는 cycle 수 - ∆ : 변화량 - ∆∆ : 변화량을 비교 - ∆Ct : Target gene Ct value – House Keeping Gene Ct value - ∆∆Ct : Target gene ∆Ct – House Keeping Gene ∆Ct

Protocol 4 ul of 5 ng/ul cDNA (Total 20ng)을 96 well plate에 넣어준다. (색깔에 맞추어서 가로로 4 ul씩 넣어주기) Forward primer, Reverse primer 그리고 SYBR Green을 다음과 같은 비율로 섞어준다. Reagent volume X5 Forward primer 0.2 ul 1 ul Reverse primer 2x SYBR Green 10 ul 50 ul DW 5.6 ul 28 ul Total 16 ul 80 ul

Protocol 2번의 mixture를 해당하는 부분에 16 ul씩 96 well 에 넣어준다. Cover를 붙여주고, 1000 rpm으로 5분간 centrifuge. PCR을 시행한다. (약 2시간 소요) Steps Condition Denaturation 95℃, 15sec Annealing 60℃, 15 sec Extension 72℃, 45 sec Cycle 40 cycle

Result 결과 예시 > Target gene (Gene X) Reference Gene (β-actin) Control (대조군) 24 19 WY14643 (실험군) 22 20 Relative mRNA level Ct 값 dCt (Target – Ref) Control (대조군) 24 – 19 = 5 WY14643 (실험군) 22 – 20 = 2 Ct 값 ddCt Control (대조군) 5 – 5 = 0 WY14643 (실험군) 2 – 5 = -3 상대비율 2^ (-ddCt ) Control (대조군) 2^(-0) = 1 WY14643 (실험군) 2^(3) = 8

Discussion Q. 이제까지의 결과들을 조합해볼 때, WY14643의 효능에 대해 기술하시오. > Key word : fatty liver, WY14643, mitochondrial b-oxidation, cpt1, ppar alpha, protein expression, luciferase expression, mRNA expression