Chapter 6 재조합 DNA 제작과 세포로의 도입 및 확인 ① 재조합 DNA ② 유전자의 대장균내 도입 방법 ③ 형질 전환된 세포의 선발 ④ 재조합 DNA 기술의 전 과정

① 재조합 DNA 유전자 재조합(DNA 재조합기술)??? 클로닝 ??? 형질 전환??? : 특정 유전자를 분리하여, 백터와 같은 다른 유전자와의 재조합으로 키메라 유전자를 만든 다음, 다시 다양한 종류의 숙주세포로 도입하여 특정 유전자를 다량 획득하거나 또는 이 유전자를 발현시키는 기술. 형질 전환??? : 재조합 DNA를 다른 세포에 도입, 발현시키는 과정. 클로닝 ??? : DNA를 재조합하고 이를 다시 숙주세포로 도입하여 특정 유전자를 다량 획득하는 과정.

재조합 DNA 분자의 제작  제한 효소에 의한 재조합 DNA 분자의 제작  PCR 산물을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작 ♥ 고려해야 할 사항: 사용하고자 하는 제한효소의 종류.

 Plasmid vector를 이용한 재조합 DNA 분자의 제작 벡터DNA와 삽입시킬 DNA를 특정 제한효소로 절단. (가능한 동일한 제한효소에 의해 생성된 동일한 점착성 말단을 두 DNA 분자가 보유할 수 있게 한다) Why??? b. 절단된 벡터와 삽입 DNA를 ligase로 연결. c. 숙주세포(E. Coli)로 형질전환을 통해 세포내로 도입. d. 재조합 DNA를 함유하고 있는 숙주세포를 선발한 후(How???) 증식하여 필요한 DNA를 다량 획득.

Q1) 벡터끼리의 자가연결을 방지하기 위한 방법 ???  송아지 장 염기성 탈인산화효소(Calf intestine phosphatase, CIP)와 같은 효소 이용. 원 리 DNA 연결효소는 한 DNA의 3’-OH와 다른 DNA의 5’-인산기 사이에 Phosphodiester 결합을 형성하는데, 만약 DNA 한 말단으로부터 인산기를 제거하면 Phosphodiester 결합을 형성할 수 없게 되므로 자가연결을 방지 . Q2) If 벡터의 삽입부위를 두 가지 종류의 제한효소로 절단이 가능하고 또한 삽입하고자 하는 외부 DNA도 이와 동일한 두 종류의 제한효소로 절단이 가능하다면 ???  자가연결과 DNA 삽입 방향성을 걱정할 필요 없이 외부 DNA를 원하는 방향으로 벡터에 삽입 가능.

교재 참조 !!!  Phage vector를 이용한 재조합 DNA 분자의 제작 : plasmid를 사용하는 경우와는 다른 전략 사용 필요. 교재 참조 !!!

 PCR 산물을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작  PCR(Polymerase Chain Reaction) Q) What is PCR ???  PCR 산물의 클로닝(TA cloning) Q) What is TA cloning ??? 교재 참조 !!!

 상동 재조합 시스템을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작  Primer에 제한효소자리를 이용하는 클로닝 교재 참조 !!!  상동 재조합 시스템을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작 원 리

클로닝 과정 및 특징

② 유전자의 대장균내 도입 방법  형질 전환  반응능 세포와 형질 전환 과정 교재 참조 !!! 교재 참조 !!!  형질전환의 이용 교재 참조 !!!  반응능 세포와 형질 전환 과정  대장균 균주(E. Coli) : DH5α, XL1-Blue, BL21, JM109 etc.  반응능 세포(Competent cell) 교재 참조 !!!

 반응능 박테리아 세포의 제작과 DNA 도입 Heat Shock

Electrophoration

Electrophoration

② Bacteriophage의 세포내 도입  형질감염(transfection)

 생체외 조립에 의한 박테리아 감염

③ 형질 전환된 세포의 선발 Plasmid vector Phage vector How ??? ① 항생제에 의한 선발 ② 삽입 비활성화에 의한 선발 ③ PCR에 의한 선발 Phage vector ① λ 유전체 크기에 의한 선발 ② phage vector가 지니는 lacZ유전자 삽입 비활성화에 의한 선발 ③ λcI 유전자 삽입 비활성화에 의한 선발 ④ spi표현형에 의한 선발 ⑤ DNA 혼성화에 의한 선발

 재조합 plasmid vector의 확인  항생제에 의한 선발  항생제 Q) 항생제란 무엇인가 ??? : 박테리아나 곰팡이 같은 미생물 중 특정한 종은 다른 미생물들에게 치명적인 물질을 생산, 분비 .  항생제 : 자신의 주위에 다른 종류의 미생물들이 살아가지 못하도록 하기 위한 것. : 제한된 영양환경을 독점.  생존환경에서 이기고자 하는 방법의 하나. : 생명 현상에 필수적인 단백질 합성이나 DNA 복제, 전사과정에 필요한 효소작용 방해.  죽도록 만듦

 주요 항생제의 종류와 작용

 항생제 선발 표지자 ex. 1 : Ampicillin에 저항성을 부여하는 β–lactamase 유전자. : Ampicillin과 결합하여 ampicillin을 분해하므로 이 유전자를 포함하고 있는 vector를 함유한 세포가 Ampicillin에 저항성 .

 항생제 선발 표지자 ex. 2 : Kanamycin에 저항성을 제공하는 NPT II(neomycine phosphotransferase type II) 유전자. : NPT ii 유전자 산물인 네오마이신 인산기 전달효소는 kanamycin을 인산화시켜 불활성화.  이 유전자를 포함하고 있는 vector를 함유한 대장균 세포가 kanamycin에 저항성

β  lacZ( - galactosidase)의 삽입 비활성화에 의한 선발 lacZ 유전자 산물에 의한 발색의 원리: plasmid의 lacZ 유전자의 산물(α-절편)은 박테리아 염색체의 LacZ유전자의 산물과 합쳐져서 완전한 효소( - galactosidase)를 이루고 X-gal을 분해시켜 청색을 띠게 한다. β

삽입 비활성화에 의한 형질전환체 선발과정(A)과 실제로 발색된 colony 사진(B) : Plasmid의 lacZ 유전자 산물( 은 대장균의 염색체 내에 존재하는 lacZ 유전자 산물( 과 함께 합쳐져서 완전한 효소 를 이루고 X-gal을 분해하여 청색을 띠게 한다. 하지만, plasmid의 LacZ 유전자 내부에 외부 유전자가 삽입되면 LacZ 유전자 산물이 만들어지지 않으므로 효소가 형성되지 못하여 X-gal을 분해하지 못하므로 대장균 colony는 흰색을 띠게 된다. Β – 절편) ω – 절편) ( - galactosidase) β

 PCR에 의한 선발 : 삽입 유전자 확인

 재조합 phage vector의 확인  λ Phage 유전체 크기에 의한 선발 : 37 ~52kb 사이의 DNA 크기 확인.  lacZ 유전자의 삽입 비활성화에 의한 선발 : plasmid와 동일한 방법.  λ cI 유전자의 삽입 비활성화에 의한 선발  Spi 표현형에 의한 선발

Q) spi(sensitive to P2 inhibition) 선발이란 무엇인가 ??? : 활성을 가지는 red와 gam유전자를 가지는 비재조합 phage는 XL-1 Blue MRA(P2)와 같이 P2 프로파지를 가지고 있는 bacteria숙주세포에서는 증식할 수 없는 원리를 이용한 선발 방법.  λ FIX phage vector는 stuffer region에 red와 gam 유전자를 가지고 있으므로 P2 프로파지를 가지고 있는 박테리아 숙주세포에서는 증식할 수 없게 된다. 그러나, Red와 gam유전자를 포함하는 비필수부위가 삽입체에 의해 대체되면 이 재조합파지는 red-gam-가 되기 때문에 P2프로파지를 가지고 있는 박테리아 숙주세포에서 증식 가능.  오직 재조합 phage vector를 포함하는 bacteria만 증식, 선발 가능.

④ 재조합 DNA 기술의 전 과정  재조합 DNA 분자 제작  숙주 세포로 운반  Colon을 형성하는 다수의 세포 획득  유용 유전자의 colon 획득 or 유용 유전자의 산물이나 기능성 생명체 획득