Western blot 생명과학 실험기법 (12주차)
실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량 Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking Primary, secondary antibody incubation Developing (using chemidoc)
Introduction 단백질의 구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등 α-나선구조 β-병풍구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등
Introduction Cell Lysis
Introduction Cell Lysis 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 0.1% SDS 1% NP-40 0.5% DOC (deoxycholate) (Option!) Protease inhibitor cocktail* *Protease inhibitor는 수많은 종류가 있어서 다양한 기전으로 여러 종류의 protease를 억제합니다. 그러므로 하나의 protease inhibitor를 사용하는 것 보다는 다양한 protease 그룹을 억제할 수 있도록 여러 종류의 inhibitor를 섞어서 사용하는 것이 효율적입니다.
Introduction Western blot
Introduction Western blot DTT / β-Mercaptoethanol
Introduction BCA assay 단백질 용액에 Cu2+ 이온을 반응시킨 후, Bicinchoninic acid(BCA)가 Trp, Tyr, Cys의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법. - 562 nm 에서의 흡광도를 측정. - Standard curve로부터 농도를 결정. (Bovine serum albumin) - 다른 방법에 비하여 detergent (SDS, Triton) 등에 의한 영향이 적음. Bradford 용액
Introduction BCA method 1.083 0.689 Bradford 용액 OD값 BSA (μg/μl) 1 2 4 1 2 4 8 16 dosage 실험 결과 SDS-PAGE OD (y값) μg/μl (x값) X = (y-0.0732)/0.0583 로딩량 (uL) /30ug 30/x값 5X loding dye DW (or RIPA) 총볼륨 =20μL A 1.083 17.32075 1.7 4 14.3 20 B 0.689 10.56261 2.8 13.2 Bradford 용액 0 5 10 15 20
Materials & Methods Cell Lysis e-tube, scraper, PBS, centrifuge, RIPA, ice, DW, 96well plate, BSA, BCA [Dish에 직접 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하는 방법] E-tube 2개를 준비하여 각각 A, B로 labeling한다. Dish에 있는 배지를 버린 후, DPBS 5ml을 넣고 washing 해준다. DPBS를 제거하고, 200μL의 RIPA buffer를 넣어주고, scraper를 이용하여 cell을 긁어서 떨어뜨리고, 이를 모아 각 e-tube에 넣는다. 15초간 vortex 하고, 30~60분간 ice에 incubation 해준다. (5-10분마다 15초씩 vortex 하여준다) 5. Cell을 모은 e-tube를 13,000rpm으로 20분간 원심분리한다. 상층액을 따서 새로운 e-tube로 옮겨준다. (이후 tube는 ice에 꽂아두도록 함)
Materials & Methods Standardization BCA reagent (A : B = 1 : 50) 7. 96-well plate에 BCA reagent (A+B) 200-㎕를 측정할 Standard, Sample 수만큼 넣어준다. 8. BSA (2000㎍/ml)을 각각 (0.5, 1, 2, 4, 8 ㎕)을 넣어 standard를 준비한다. 9. Sample을 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 duplicate로 준비한다. 9. 37℃ 에서 20분간 incubation 한다. 10. Microplate reader로 562nm으로 측정 후, 정량곡선을 그린다. BSA BSA 1 BSA 2 BSA 4 BSA 8 BSA 16 A A B B BCA reagent (A : B = 1 : 50)
Plate layout Materials & Methods 농도 1 2 4 8 16 샘플 C 샘플 T
Result 0.245 3.2 μg/μl 9.4 μl 4 μl 5.6 μl 20 μl 0.204 2.1 μg/μl 농도 OD 0.113 1 0.141 2 0.209 4 0.3 8 0.434 16 0.716 샘플 C 0.245 샘플 T 0.204 샘플 단백질 정량 결과 SDS-PAGE OD (y값) 농도 (x값, μg/μl) X = (y-0.1245)/0.0376 A: 단백질 (30 μg) B: 5X dye C: DW 총부피 (A+B+C) C 0.245 3.2 μg/μl 9.4 μl 4 μl 5.6 μl 20 μl T 0.204 2.1 μg/μl 14.2 μl 1.8 μl
Discussion Q1. Lowry method, Bradford method에 대해 알아보세요 Q2. 실험수업에서 진행한 방식에 따라 BCA assay를 진행할 때, 샘플을 1 μl 가 아닌 2 μl를 취하여 OD를 측정하였다면 최종 농도는 어떻게 계산되어져야 할까요?