[Buffer 및 시약제작] 일반 생명과학 실험 신경과학연구실.

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1 [Buffer 및 시약제작] 일반 생명과학 실험 신경과학연구실

2 Summary 생물학적 Buffer란? Buffer의 기본원리 Buffer 만들기

3 실험목표 완충용액의 원리와 종류, 용도를 이해하고 실험에 따라 알맞은 완충용액을 사용 할 수 있도록 한다.

4 생물학적 Buffer란? 완충액이라고도 하며, 가장 큰 특징은 외부로부터 어느 정도의 산이나 염기가 첨가되어도 영향을 크게 받지 않고 수소이온농도를 일정하게 유지하는 용액 위와 같은 특성으로 인해 Buffer는 생물 실험에 널리 이용 실험의 방법 (Western blotting(protein), Southern blotting(DNA), Northern blotting(RNA), IF 등)에 따라 여러 가지 종류의 buffer를 제작해서 사용한다.

5 Buffer의 기본원리 소량의 산을 가하는 경우 H+ + Aㅡ → HA 반응에 의해 수소이온이 없어지기 때문에 pH의
변화는 거의 없음 마찬가지로, 소량의 염기를 가할 경우에도 OHㅡ + HA → Aㅡ + H2O 반응에 의해 OHㅡ 이온이 없어지기 때문에 pH 는 비교적 일정하게 유지됨

6 완충용액의 예

7 중화적정 곡선 산-염기 중화 적정에서 가해준 산이나 염기의 부피에 따른 용액의 pH변화를 나타낸 곡선

8 준비물 각 버퍼에 맞는 시약 (Tirs, EDTA, SDS, Glycine,) 교반기, 마그네틱바, 미세저울
시약스푼, 시약종지, 비커, 플라스크 메스실린더, 여과지, 랩 등

9 준비물

10 준비물

11 실험기구 주의사항 비커, 메스실린더, 삼각플라스크(유리제품) 사용시 파손주의 고체 시약 흘리지 않기 (발화성, 휘발성)
시약수저 섞어 사용하지 않기 (오염,반응) 시약 사용 시 수분 들어가지 않도록 마그네틱 바 & 교반기 사용시 용액 튀지 않게(랩 사용) 마이크로 피펫 사용시 오염주의 사용 후 깨끗이 씻기 & 알코올 뿌리기 & 뒷정리

12 3. 질량과 무게 측정 4.1 저울 사용법 ① 저울을 바람이 불지 않는 평평한 곳에 놓고, 평형을 확인한다.
② 저울의 전원을 켜고, 유리문을 닫은 후 저울이 안정화 될 때까지 기다린다. (안정화 되면 화면에 * 모양이 뜬다) ③ 시약을 담을 기름종이, 튜브 등을 저울 위에 올리고 0점을 맞춘다. ④ 0점을 맞춘 후, 사용하고자 하는 시약의 무게를 측정한다.

13 Buffer 만들기 (Western blot)
➃ ➀ No filtering Tris (pH6.8) Tris 3 g (0.5M) EDTA 2 ml of 0.2M SDS 2 ml of 10%SDS ddH2O(Total Volume) 50 ml 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) SDS 3 g ddH2O 30 ml ➁ No filtering and voltexing EDTA (0.2 M) EDTA 0.744g ddH2O(Total Volume) 10 ml ※시약들을 다 녹인 후에 최종 Volume을 맞춰야 한다.(즉 처음에는 만드는 최대 Volume의 50~70% 정도만 넣어 용해시킨다.) 최종 Volume을 맞춘 후 완성된 용액을 Filtering 해야 한다. ➂ Tank buffer Tris 0.75 g Glycine 3.6 g SDS 2.5 ml of 10%SDS ddH2O(Total Volume) 250 mL

14 BUFFER 만들기 순서 장갑 및 마스크 실험복을 착용한다. 전자저울을 이용해서 시약의 무게를 잰다.
기름종이나, 시약 접시 이용. 저울의 평형, stable 맞추기 기름종이, 시약 접시를 얹은 상태에서 stable 맞추기 시약 수저로 시약재기 (한번 잰 것은 다시 넣지 않기) Stable 기다리기 비커에 넣는다. (천천히 날리지 않게, 표면에 붙어있는 시약도 피펫과 증류수를 이용해 모두 넣어준다.) 저울 정리 (알코올)

15 BUFFER 만들기 순서 및 주의사항 다 만든 용액은 폐기처리 한다.
교반기에 용액이 든 비커를 얹고 마그네틱바를 이용해 용액을 섞는다. (마그네틱바는 기울여 비커를 타고 내려가게 해야 비커가 손상을 입지 않는다.) 시약 + 증류수의 볼륨은 최대볼륨보다 작게 (약 50%~70%) 교반기 작동 시 마그네틱바의 회전 관찰 SDS의 경우 거품이 많이 발생하므로 섞을 때 주의! 용액이 튀지 않게 비커 위를 랩으로 덮는다. 작동시킨다. 적정 볼륨을 맞춘다. (피펫 등을 이용) 완성된 용액은 필터페이퍼로 필터링 해준다. (이물질 제거 등) 다 만든 용액은 폐기처리 한다.

16 Next time - 결과보고서 버퍼 제작 시 사용되는 기구의 사용법에 대해 간략하게 정리
버퍼를 만들 때 주의사항에 관해 간략하게 정리 우리가 만든 버퍼(Tris-HCl (pH6.8), Tank buffer) 가 Western blotting에 어떤 용도로 사용되는지에 관해서 조사해오기 (상세히)

17 Next time - 예비보고서 강연속성 (river continuum concept)이란?
수질 조사 시 이용되는 기본적인 측정항목에는 무엇이 있는가?