손동화, 류충호 (한국식품연구원, 경상대식공과) 천연물로부터 식품알레르기 제어소재 선발 손동화, 류충호 (한국식품연구원, 경상대식공과) 2010.2.26 삼성병원 식품면역연구회
2) Th2 면역반응유도 → IL-4 등 분비 → IgE 항체생산 및 이를 복합적으로 활용하는 종합적 대응방안 필요 실험배경 및 중요성 최근 알레르기(아토피피부염, 알레르기성비염, 천식, 식품알레르기 등) 환자증가심각한 사회문제로 대두, 소아에게 많이 발증되는 식품알레르기 대응방안 필요 알레르기 발증 과정 1) 알레르겐 체내침입 2) Th2 면역반응유도 → IL-4 등 분비 → IgE 항체생산 → 아토피상태 [제1단계] 3) 재침한 항원이 IgE 항체와 결합 → mast cell 자극 → 탈과립유발 → 혈관확장, 호산구 등 세포이동 및 작용 → 알레르기성 염증반응유발 [제2단계] 각 발증단계 조절하는 활성물질발굴 및 이를 복합적으로 활용하는 종합적 대응방안 필요
연구의 필요성 근년, 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는 알레르기 (아토피피부염, 알레르기성 비염, 천식, 식품알레르기 등)는 사회적인 문제가 되고 있음. 미국에서는 5,000만명이 알레르기 질환을 갖고 있음 (의약품시장 $52억). 21세기에 주류 치료제는 알레르기와 당뇨에 대한 것임 (닛케이산쿄신문). 일본의 알레르기 의약품시장: 1,560억엔, 기능성식품시장: 약 600억엔임. 국내의 의약품시장: 500억원의, 기능성식품시장: 150억원으로 추정됨. 최근 일본 기능성식품의 특허출원, 1위: “항비만”, 2위: “항알레르기”임. 향후 높은 부가가치가 기대됨. 기존 연구에서는 단일소재의 단일활성에 대한 항알레르기 연구가 주류이나 선발을 위하여 다양한 소재들의 여러활성을 입체적으로 검토해야 함. 특히, 식품알레르겐의 소장상피세포층 통과를 억제하는 활성소재에 대한 연구는 전세계적으로 극히 미비한 상태임.
연구목표 및 내용 천연물 및 식품으로부터 식품알레르겐의 소장통과 및 알레르기 발증을 조절할 수 있는 물질들을 탐색하고, 유용성분을 활용하여 알레르기억제 기능성 식품소재를 개발 연구목표 연구내용 및 범위 항알레르기 활성소재 6종 이상 선발 3종 활성시험계 이용한 활성소재 선발 (1) 알레르겐의 소장통과 제어계 In vitro Caco-2 monolayer (2) IL-4 (Th2 cytokine) 생산 제어계 Ex vivo Murine spleen cell (3) 염증(탈과립) 억제 시험계 In vitro RBL-2H3 cell 4 4
연구방법 ○ 시료: 식품 및 천연물 106종 (1g) + 50% EtOH(25ml) microwave (90w, 5min) 증발농축 최종 5mL로 조절 막여과후 활성시험 “발증단계별 조절 활성 측정”
In vitro Caco-2 monolayer 이용 알레르겐의 장 상피세포층 통과억제 소재선발 In vitro Caco-2 monolayer 이용 ○ 목적: 식품알레르기 발증 전 단계인 알레르겐 체내흡수를 제어하는 활성소재 발굴을 위해 소장 환경과 유사한 실험계를 활용 ○ 활성시험: Transwell 상에서 2~3주간 Caco-2 cell 배양 monolayer 형성 확인 상층부(0.5mL)에 시료(10uL) 첨가 1시간 후 알레르겐(OVA)과 bile salt(150ug/mL) 첨가 3시간 후 TEER측정/ 하층부(1.5mL)의 OVA측정 by ELISA *TEER: 세포층이 가지는 전기적 저항치/장상피세포 간극의 건전성 지표로 활용 ○ [Rel. Reflux < 20%] & [Rel.TEER >100%] #4, 17, 54, 78, 101, 103 (IC50 < 10ug/mL) /#14, 63, 104
IL-4 생산억제 활성소재선발 감작생쥐 비장세포배양계 이용 ○ 목적: 알레르기 발증의 제1단계 (Th2반응에 의한 아토피상태로의 발전)를 제어하는 활성소재 발굴 ○ 활성시험: Ex vivo 비장세포배양 BALB/c생쥐, 암컷(5주령) 1주후: OM(50ug)을 alum(2mg)과 함께 2주간격 2차례 복강면역하여 알레르기유발 1주후 비장세포 배양: 항원 존재하에 소재추출물을 첨가 3일후 상징액 중 IL-4 분석(ELISA) ○ IL-4 생산억제 70% 이상 #2, 7, 79, 98 (IC50=~10ug/ml) / #16, 23, 35, 47, 48, 78, 101, 103
탈과립억제 활성소재선발 RBL-2H3 세포배양계 이용 ○ 목적: 알레르기 발증의 제2단계 (항원자극에 의한 탈과립으로 유도되는 염증반응) 제어소재의 발굴 ○ 활성시험: In vitro RBL-2H3 세포주 배양 ○ Histamine 유리억제 활성시험 24well에 seeding 하룻밤후: 소재추출물 처리 1시간후: 자극제(A23187+PMA) 처리 8시간후: 배양액 회수 Histamine 정량 (by ELISA) ○ β-hexosaminidase 유리억제 활성시험 24well에 seeding, 0.5 ug/ml anti-DNP IgE 첨가 하룻밤 배양 Siraganian 완충액으로 세척 소재추출물 10 ㎕를 첨가 DNP-HSA (1㎍/ml) 20㎕를 첨가 상징액 회수 β-hexosaminidase의 활성 측정 (A405) Histamine 분비억제 활성 Sample No. ○ Histamine 유리억제 50% 이상 #5, 7, 49 (IC50=~50ug/ml) / #33, 42, 61, 66, 67, 79, 83, 100, 101, 105, 106 ○ β-hexosaminidase 유리억제 40% 이상 #5, 83, 101, 106/ #7, 21, 49, 57, 61, 66, 79, 87, 100, 105 ○ 결과: 두 활성간에 상관성 높음
알레르기 억제활성 (종합) ○ 입체적인 활성소재의 비활성 파악에 용이 ○ 혼합을 위한 기본소재의 선발에 활용
활성소재 선발 ○ 우선 선발기준: ○ 활성 특성비교: 3종의 활성시험에서 높은 활성을 나타낸 것 식품 소재를 중심으로 선발 ○ 우선 선발기준: 3종의 활성시험에서 높은 활성을 나타낸 것 식품 소재를 중심으로 선발 - 독성의 문제가 있는 것은 제외 9종 선발 ○ 활성 특성비교: 활성시험 결과 점수 합계 알레르겐의 장상피세포층 통과저해 IL-4생산 저해 탈과립 저해 #4 +++ + 5+ #5 #16 ++ 8+ #33 6+ #35 #86 #98 7+ #101 #106
선발소재혼합(1:1)에 의한 상승작용 활성 종류 우수 활성소재 1:1혼합 상승작용 [일부Data 생략] ○ IL-4생산 억제활성에 미치는 영향 (Fig.) 혼합에 의한 상승작용 확인 처리구: (36) (13개) 상승작용에 관여하는 중요 활성소재: (4개) #33, #86, #98, #106 단독 (9) 1:1혼합 (36) ○ Ex vivo 결과 종합 ○ 소재(9종): #4, #5, #16, #33, #35, #86, #98, #101, #106 활성 종류 우수 활성소재 1:1혼합 상승작용 [일부Data 생략] 소장통과 억제활성: #4, #16, #101 #4, #16, #35 IL-4생산 억제활성: #16, #98 #86, #106, #98, #33 탈과립 억제활성: #5, #106 #5, #101, #16, #98
요약 / 결론 106점의 식품 및 천연물로부터 알레르기 제어 관련 3종의 활성시험을 도입하여 활성을 측정하고 이들 소재가 가지는 활성을 입체적, 상대적으로 비교함으로써 9종의 활성소재를 우선 선발. (1) 알레르겐의 소장상피세포 통과 억제 활성소재 : 감초 등 (2) Th1/Th2 면역반응 (제1단계 알레르기 발증관련) 제어에 관여하는 IL-4생산억제 활성소재 2종: 녹차 등 (3) 알레르기성 염증반응 (제2단계 알레르기 발증관련) 제어에 관여하는 탈과립억제 활성소재 2종: 강황 등 * 그 외에 여러 활성이 고르게 높은 활성소재: 민들래 등 선발소재 9종 추출물을 혼합(1:1)시 상승작용을 나타내는 소재 확인. 혼합물을 항알레르기 소재로 활용가능