Lecture 11 Automated Cell Counting Instrumentation Keohane EM, Smith LJ, Walenga JM Rodak Hematology 5th Ed, 2016, Chapter 15 Elaine M. Keohane, PhD, MLS(ASCP),SH keohanem@shrp.rutgers.edu Rutgers-The State University of New Jersey School of Health Related Professions and Kyung Jin Cho, PhD chokj@korea.ac.kr Korea University, College of Health Sciences May 24, 2019

CBC (전혈구계산) 구성 White Blood Cell Count (WBC) Red Blood Cell Count (RBC) Hemoglobin (HGB) Hematocrit (HCT) Platelet Count (PLT) Mean Cell Volume (MCV) Mean Cell Hemoglobin (MCH) Mean Cell Hemoglobin Concentration (MCHC) Red Cell Distribution Width (RDW) WBC Differential Count (Relative and Absolute) NRBC Reticulocyte Count (RETIC), IRF Other parameters

혈액분석장비(Hematology CBC Analyzer) 장점 신속한(faster turn around time) 검체 처리 보다 효율적이며, 비용-효과적 임 √ 보다 정확(accurate)하고, 정밀(precise) 함 숫자 적은 비정상세포들에 대해 높은 민감도(sensitivity) √ 세포집단에 대한 보다 많은 정보 제공 √ 그럼에도 불구하고 의심스러운 일부 검체에 대해서는 임상병리사에 의한 말초혈액 도말표본의 검경이 요구 됨

√ Electrical Impedance(전기저항) 혈액분석장비(Hematology CBC Analyzer) – 계속 혈액장비의 주요 측정 기술 √ Electrical Impedance(전기저항) 저 전압 직류 저항 (DC Resistance) 고 전압 교류 저항 [AC(RF) Resistance] √ Optical Scatter (광 산란) Laser Light Non Laser Light

Electronic Impedance Principle (전기저항 원리) 1950년대, W. Coulter에 의해 개발 전도성액체에 부유된 세포를 음압펌프를 이용하여 aperture tube의 세공을 통해 흡인하면서 전기저항이 발생 미세공 수조내 외부전극과 aperture tube내 내부전극 사이 저전압 직류전기 연결 됨 Fig 15-1. Coulter Principle of Cell Counting. Keohane EM et al. Rodak Hematology, Elsevier 2016, p209

Electronic Impedance Principle - Continued 미세공수조 내 부유혈구들이 미세공 통과하면서 양극사이에 형성된 전류저항(전압펄스)을 측정 [Coulter counter 의 최근 모델의 경우, 미세공수조내 (RBC/PLT 용- 직경 50 μm, 길이 60 μm; WBC/Hb 용- 직경 100 μm, 길이 75 μm)크기 의 3개 씩의 미세공을 이용하여 전압펄스 측정] 이러한 전류저항이 만들어낸 전압펄스를 장비가 기록하게 됨 √ 펄스 수는 세포 수에 비례하며, 펄스 파고는세포 용적/크기에 비례 함 The Coulter Principle Aperture bath (미세공 수조)

Electronic Impedance Principle - Continued Fig 39-2: Modified from Coulter Electronics, Inc. From Rodak, Fritsma, Keohane, 2012, p. 599. 파고분석기는 일정간격으로 설정된 size thresholds에 의해 모든 펄스를 각 펄스크기(혈구크기)별로 분류 함 X-축:용적, Y-축:혈구수로 표시되는 크기분포히스토그램(size distribution histogram)상에 측정값을 플롯 함

RBC and PLT 전압펄스 펄스파고분석기에서의 √ DC Impedance - 장비 내로 흡인된 검체는 두 분획으로 나뉘어 RBC/PLT 측정 챔버(수조); WBC/Hb 측정 챔버 에서 각각의 등장액으로 다른 비율로 희석 됨 - RBC/PLT 측정용 미세공 챔버내에서 측정되는 RBC와 PLT 두 종류 세포의 구분은 전압펄스 크기에 의해서만 구분 2 20 36 360 Background Platelets RBC Giant PLT or PLT Clump PLT window RBC window WBC

WBC 전압펄스 DC Impedence - - WBC종류 별 분류는 전압펄스 크기에 의해서만 이루어짐) 35 90 450 Background, Platelets 림프구 단구 NRBCs, Giant PLT or PLT Clump 160 과립구 과립구 window 림프구 window 단구 window Total WBC * WBC 채널에서 고유의 lysing sol은 백혈구 종류별 차등화 수축을 일으킴

무선주파수(RF) 저항 Radio-frequency (RF): -두 전극사이의 고전압 전자기 펄스 활용 - cell conductivity (세포전도성- RF resistance)는 다양한 조건에 의한 전도성의 차이를 활용 : √ 세포 내부 상황(내용물) 핵:세포질 비(N:C ratio) 핵 밀도 세포질 내 과립 세포 용적(크기) (보정 이루어져야 함)

DC vs RF 산점도 세포 내부 복잡성 세포 크기(용적) (Internal complexity) (Size) 세포 크기(용적) (Internal complexity) (Size) 저전압 직류저항으로는 크기나 용적을, 고전압의 무선주파수 저항으로는 세포 내부상태를 동시에 측정 하여 2차원의 산점도에 표시하면 세포의 여러 특성에 따라 세포들이 집단을 구성하는데 이를 컴퓨터 군집분석으로 집단을 구분하게 됨 Figure 15-4: Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 210

광 산란(Optical Scatter) Flow Cytometer에서 측정 Laminar Flow (박층흐름) http://flow.csc.mrc.ac.uk/wp-content/uploads/fcm-fig2-flow-cell.jpg LASER 광 산란(Optical Scatter) Flow Cytometer에서 측정 Laminar Flow (박층흐름) 가늘고 긴 채널을 통해 검체가 한 줄로 흐르도록 유도 √ Hydrodynamic focusing (유체역학적 집속) 검체가 수정으로 된 플로우셀 (flow cell)을 통하면 외장흐름(sheath fluid)에 감싸여 세포들이 하나씩 일렬로 정렬하여 흐르게 됨 집속을 통해이 영역을 가로지르는 레이저 광은 혈구 하나가 지날 때 마다 흡수, 회절, 굴절, 반사와 같은 광산란을 일으키는 데, 혈구마다 특징적인 광산란을 일으켜, 혈구를 계수/분류 한다. Light Source: Tungsten halogen Helium-neon laser (레이저는 단일파장의 빛을 방출) Light Scatter

Flow Cytometry(흐름세포분석) http://flow.csc.mrc.ac.uk/wp-content/uploads/fcm-fig3-scatter.jpg √ 전방산란(FS): 세포용적/크기 측정 √측방산란(SS) 또는 90 산란: 세포 내 내용물 측정 Blocker bar: 레이저광원에서 나오는 직진광의광검출기 진입 차단장치. 즉, 산란광만 광검출기에 도달 함 Laser

Light Scatter (광산란) 광산란 종류 측정대상 √ 전방산란(FS): (00) 세포 용적(크기) √ 직교/측방 산란(SS): (900) 세포내부 복잡성/ 분엽성 √ 전방저각산란(FLS) (2-30) 세포용적 및 굴절지수(RI) 또는 세포내부 복잡성 전방고각산란(FHS) (5-150) 중간각 광산란 –RLS* (10-700: 세포내부구성물 측정에 최적 각도 활용) 세포내부 복잡성 √ 형광 그물적혈구의 RNA nRBC의 DNA *RLS (Rotated light scatter): 용적은 비슷; 내부구성물에 따라 다른 광산란 보이는 세포 분류시

√ Common Components (공통 기본 구성요소) 자동혈구계산기 구성요소 √ Common Components (공통 기본 구성요소) Hydraulics(유체시스템): 흡인장치, 분주장치, 희석장치, 혼합실, Flow cell, 혈색소측정장치 Pneumatics(공기역학시스템): 밸브를 작동시키고 검체를 시스템 전체로 이동시키는 진공과 압력 시스템 Electrical(전기시스템): 분석기, 컴퓨터, 자료, 디스플레이, 프린터이 작동하도록 함

[Beckman Coulter] 직접측정 항목 RBC, PLT - DC impedance 측정 √ MCV – RBC용적분포를 이용한 평균RBC용적 Hgb – 수정 CyanmetHb법 WBC – VCS technology MPV - Plt용적분포를 이용한 평균PLT용적 √ 연산 산출: HCT*, MCH, MCHC, RDW *: Hct = (MCV x RBC) / 10

RBC 와 PLT 계산- 전기저항 측정 Platelets: 2-20 fL RBCs: > 36 fL Beckman Coulter – Cont’d RBC 와 PLT 계산- 전기저항 측정 혈소판과 적혈구는 동일 미세공수조(aperture bath)에서 계수 Platelets: 2-20 fL RBCs: > 36 fL √ RBC계수 중에는 WBC도 적혈구로 계수되지만, WBC수가 >50 x 109/L을 넘지 않는다면 큰 의미 없음 Normal RBC 4.0-6.0 x 1012/L Normal WBC 4.5-11.0 x 109/L

RBC 와 PLT 전압펄스 비교 Beckman Coulter – Cont’d 360 36 20 2 Platelets RBC Background Platelets RBC √ Giant PLT, PLT Clump PLT window RBC window √ WBC

√ RDW 와 RBC Histogram # cells Beckman Coulter – Cont’d √ Normal MCV Increased RDW Normal MCV # cells 90 fL 70 fL 110 fL Normal RDW √ Normal MCV √ Normal MCV = 80-100 fL √ Normal RDW = 11.5-14.5%

Giant PLTs, Clumped PLTs, Micro RBCs Beckman Coulter – Cont’d √ Platelet Histograms 2 fL 혈구수 20 Giant PLTs, Clumped PLTs, Micro RBCs 커다란 혈소판의 간섭으로 곡선이 기준선에 닿지 못함 정상분포 √ Noise, Debris, 세균 작은 입자들의 간섭현상 혈구수 혈구수

Beckman Coulter – Cont’d WBC계산(전기저항)과 Hb 측정 WBC/Hb bath에서 RBC는 용혈되어 (WBC와 Hb 측정 위해), WBC는 아형별로 차등화 수축 됨 Lymphs 35-90 fL Mononuclear (Mono, blast, atypical lymph) 90-160 fL Granulocytes 160-450 fL Total WBC 35-450 fL nRBCs, Giant platelets, Platelet clump들이 >35 fL이면, WBC로 계수 됨. 신형장비는 핵의 DNA에 결합하는 형광염료 이용하여 nRBC검출 후, 자동으로 Total WBC에서 차감하여 nRBC에 대한 부분을 보정 함 WBC계수 후, 백혈구희석액은 다시 혈색소측정 unit으로 이동 후, 525nm파장대에서의 흡광도 이용하여 혈색소 측정

WBC Voltage Pulses Beckman Coulter – Cont’d 35 90 450 Lymph Background, Platelets Lymph Mono Blast, Atyp,Lymh Imm.Granulo NRBCs, Giant PLT or PLT Clump 160 Gran Gran window Lymph window Mono window Total WBC

√ WBC Histogram Coulter: 3 Part Differential Total WBC 35-450 fL Beckman Coulter – Cont’d √ WBC Histogram Coulter: 3 Part Differential Lymphs 35- 90 fL Mononuclear 90-160 fL* Granulocytes 160-450 fL Total WBC 35-450 fL 50 100 200 400 Lymph Mono- nuclear Granulocytes # cells fL (35-90) (90-160) (160-450) * Mononuclear영역에서는 monocytes외에도 reactive lymphs, 일부 blasts, 미성숙 과립구도 포함 됨

Coulter STKR (구형 model) Beckman Coulter – Cont’d Coulter STKR (구형 model) R2 RM √ R1 R1 flag: Excess signal at the lower threshold region R2 flag: loss of valley owing to overlap or insufficient separation between the lymps and mononuclear population at 90 fL region Platelet: high takeoff – electronic noise, nRBCs, unlysed RBCs, clumped PLTs Figure 15-5: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 213

Beckman Coulter – Cont’d VCS 기술 (최근 model) Volume(용적) – DC impedance(전기저항)원리에 기반; cell volume (size)를 측정 Conductivity(전도성) – 무선주파수(RF)의 전자장에너지는 세포 관통하여 세포구조의 복잡성 측정. 전도성신호는 용적보정 후 Opacity(불투명도)값 표시 Scatter(산란) – laser광이 세포에 부딛히면서 광산란일으킴; 중간각도(10°-70°): RLS(회전광산란)*신호를 집적하여 과립성, 분엽성, 세포 표면구조 특성추정 *RLS (Rotated Light Scatter, 회전광산란): 세포종류별 내부구조물에 의한 산란에 최적의 측정 각 활용. (동일용적이라도 서로 다른 산란 각 이용하면 세포구분 용이) 0°각축광소실 (axial light loss, AL2), 저각산란 (low-angle light scattter, LALS), 중각산란 (median-angle scatter, MALS), 하중각산란(LMALS), 상중각산란(UMALS) √ √

V (volume): lymphs vs. monos 감별 Beckman Coulter (VCS 기술) – Cont’d 3차원 분석 - 3D Scatterplot 5-part differential V (volume): lymphs vs. monos 감별 S (scatter)/RLS: neut vs. eos vs. baso 감별 C (conductivity)/Opacity: lymph vs. baso 감별 Vol Scatter (RLS) Conductivity (Opacity) Eosinophil Neutrophil Monocyte Lymphocyte Basophil

Beckman Coulter – Cont’d V RLSn AL2 LALS LLSn OP UMALS Figure 15-6: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 215

[Sysmex] RBC/PLT - DC impedance 측정 Hct: RBC펄스 파고 누적치로부터 산출 동시발생(coincidence) 신호를 감소시키기 위해 hydrodynamic focusing(유체역학 집속) 원리 활용 Microprocessor가 하한/상한의 가변역치(Floating threshold)설정 PLTS 2~6 fL to 12~30 fL RBCs 25~75 fL to 200~250 fL (PLT 응집, 거대혈소판, 세포 조각 등을 구분 용이 함) Hct: RBC펄스 파고 누적치로부터 산출 √ Hb: MetHb+ sodium lauryl sulfate: SLS-metHb 형성 (유해성 낮음) Retics – 형광염색 후 형광강도로 Retic 감별 MCV, MCH, MCHC – 연산(컴퓨터)에 의한 산출

Total WBC - DC impedance 측정 Sysmex- Cont’d Total WBC - DC impedance 측정 [ 4개 검출 챔버: SE-9000 ] 모든 RBC 용혈 후 수행 DIFF: Lymph, Mono and Granulocytes 분류 [일단, RF(y-축)/DC(x-축) 검출로 3-prat 감별] IMI: 미성숙골수구계(imm. granulocytes)계 세포 정보 온도/화학적처리하여 미성숙과립구 제외 기타 WBC 선택적 수축 미성숙세포 분석을 위해서는 DC/RF기술 사용 EO/BASO: Eo와 Baso 별도채널에서 Eo, Baso 각각 산출 Eo, Baso 제외한 나머지 WBC를 선택적 수축(온도/화학적 처리) 두 개 채널에서 각각 세포-특이적 시약 사용하여 DC법으로 측정 총과립구(Total granulocyte)에서 Eo, Baso수 차감으로 Neut count 결과 얻음

Sysmex 2100 WDF* Mono Neut + Baso Lymph Eo Sysmex- Cont’d Sysmex 2100 WDF* Eo Neut + Baso Lymph Mono SSC SFL 적혈구 용혈시키고, WBC막에 구멍을 낸 후, 형광염료로 DNA, RNA를 염색 *: WDF, WBC differential; SFL, side fluorescence

√ Sysmex- Cont’d WNR: WBC, Baso, nRBC WBC perforated IRF Baso WBC nRBC After RBC lysing, DNA,RNA stained with fluorescent dye Polymethine stains the nuclei with nRBC low / WBC high IRF √ Baso WBC nRBC RBC LFR MFR-HFR Debris Lymph Mono Neut + Baso Eo WNR: WBC, Baso, nRBC WBC perforated In the WDF channel, RBC lysed, WBC membrane perforated and DNA,RNA stained with fluorescent dye (side fluorescence light) In WNR (WBC, Baso, nRBC) channel, RBC lysed, WBC perforated, polymethine fluorescence dye stain WBC nuclei with high fluorescence, nRNC nuclei with low fluorescence IRF: Erythro:LFR-MFR-HFR IPF Figure 15-7: Printout from Sysmex XN-1000 Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 217

IRF in Automated Retics Counting (Sysmex XE-2100…) Sysmex- Cont’d IRF in Automated Retics Counting (Sysmex XE-2100…) BM recovery: IRF >5% IRF, immature reticulocyte fraction; MFR, middle-fluorescence ratio; HFR, high-fluorescence ratio SFL FSC http://www.sysmex.ru/files/articles/Xtra_online_reticulocytes.pdf

[Cell-Dyn (Abbott)] WBC – 두 가지 측정 원리 RBC/PLTS – 전기저항 원리 광학 원리 RBC/PLTS – 전기저항 원리 RBC >35 fL PLT 1-35 fL Hgb – 수정 CyanmetHb 법 MCV – 적혈구용적분포를 이용한 평균적혈구용적 Hct, MCH, MCHC – 연산에 의한 산출 5 part Diff: CELL-DYN Sapphire, CELL-DYN Ruby

Cell-Dyn – Cont’d 5 part Differential 다각편광산란분리 (MAPSS) 기술 Polarized Helium Neon Laser √ 4 Scatter Measurements Taken 00 Size (용적) 900 Lobularity (분엽성) 7/100 Complexity (복잡성) 900D Granularity–depolarized (과립성) 3개 Scatterplot [산점도]를 이용한 세포 감별

Cell-Dyn MAPSS Technology Cell-Dyn – Cont’d Cell-Dyn MAPSS Technology Figure 15-8A: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 218

Cell-Dyn – Cont’d [산점도 1] 900 (분엽성) 70 (복잡성) 분엽성(900) vs. 복잡성(70)으로 70 (복잡성) 900 (분엽성) 다형핵구 – 단핵구 감별 [산점도 1] 분엽성(900) vs. 복잡성(70)으로 다형핵구 vs. 단핵구 감별 Figure 15-8B: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 218

Cell-Dyn – Cont’d [산점도 2] 900D (과립성) 900 (분엽성) 호산구 – 호중구 감별 [산점도 2] Plot 1 결과의 PMN cell 이용, 과립성(900D) vs. 분엽성 (900)으로 호산구 vs. 호중구 감별 Figure 15-8C: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 218

Cell-Dyn – Cont’d [산점도 3] 00 (용적) 70 (복잡성) 단핵구 분석 백혈구 감별 [산점도 3] 단핵구 분석 용적 (00) vs. 복잡성(70)으로 Lymph, Mono, Baso를 구분 00 (용적) 70 (복잡성) Figure 15-8D: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 218

Cell-Dyn – Cont’d Neut Eos Retic RBCs PLTs Reti-PLts WBCs Mono Neut Figure 15-9: Rodak 혈액학, Keohane EM, 2016, p. 226 Neut Eos Retic RBCs PLTs Reti-PLts WBCs Mono Neut

[Siemens Healthcare – Advia] RBC/PLTS – 광산란 RBC: 용적은 저각(2-30), 내부복잡성(Hb농도*)은 고각(5-150)이용 동시측정 PLT: 용적은 저각 (2-30), 굴절지수는 고각(5-150)을 이용하여 동시 측정 됨 혈소판계산에는 RBC잔해, 유령세포는 제외되지만, 대형혈소판은 포함되어 보다 정확한 혈소판계산 가능 Hgb – 수정 CyanmetHb Hct, MCH, MCHC – 연산에 의해 *CHCM: Cell Hb Concentration Mean

WBC/Differential - 광학(Tungsten Lamp), 세포화학 [Siemens Healthcare – Advia]- Cont’d WBC/Differential - 광학(Tungsten Lamp), 세포화학 2 채널 (Peroxy채널 vs. Baso채널) 1) Peroxy 채널 (호중구, 단구, 호산구의 과립 내 존재) Step 1: 반응조 내에서 Sod dodecylsulfate에 의해 RBC 용해 Step 2: WBC는 Perox1 sol (fixative)에 의해 고정 Step 3: WBC Perox 2 (4-chloronaphthol), Perox3 (H2O2)에 의해 염색 peroxidase in granules H2O2/4-chloro-1-naphthol ppt Y-축: 전방산란 (FS-세포크기); X-축: 흡광도 (Peroxidase활성도)를 플롯 과립구-우측 상단; 림프구-좌측 하단에 위치

Peroxidase 채널 (FSC vs. Peroxidase OD) Siemens Healthcare - Advia Peroxidase 채널 (FSC vs. Peroxidase OD) Scatter Peroxidase Absorbance Neut Monos Eos LUC Lymphs Debris NRBC PLTs LUC = Large Unstained Cells (such as blasts, reactive lymphs) more less Peroxy activity FSC LUC Atyp lymp Blast Mono Granulo Imm Gran Lymph nRBC/Plts Debris

2) Baso/Lobularity 채널 시약은 Baso 외 모든 세포의 세포질을 제거(strip): Siemens Healthcare - Advia 2) Baso/Lobularity 채널 시약은 Baso 외 모든 세포의 세포질을 제거(strip): 호염기구는 수평역치 윗쪽에 분포; 나머지 세포는 Basophil 아래쪽에 분포 X-축(복잡성): 오른쪽에 분엽세포, 왼쪽에 단핵세포 위치 함 WBC- Baso: 1° WBC count WBC-Perox: 2° WBC count 재점검 http://rbclab.com/Pages /200/250/250.1/250%201.html

Advia Siemens Healthcare - Advia Figure 15-12: Printout from Coulter STKR ,Rodak Hematology Keohane EM, 2016, p. 222

√

√