2015.05.18 Western blot. 1. Western blot Western blot 과 면역염색법 (Immunostaining) 은 여러 단백질의 혼합물로부터 찾고자 하는 단백질 에 대한 항체를 사용하여 항원 - 항체 반응을 일으킴 으로써 특정단백질을 찾아내는.

Presentation on theme: "2015.05.18 Western blot. 1. Western blot Western blot 과 면역염색법 (Immunostaining) 은 여러 단백질의 혼합물로부터 찾고자 하는 단백질 에 대한 항체를 사용하여 항원 - 항체 반응을 일으킴 으로써 특정단백질을 찾아내는."— Presentation transcript:

1 2015.05.18 Western blot

2 1. Western blot Western blot 과 면역염색법 (Immunostaining) 은 여러 단백질의 혼합물로부터 찾고자 하는 단백질 에 대한 항체를 사용하여 항원 - 항체 반응을 일으킴 으로써 특정단백질을 찾아내는 기법이다.

3 2. Ag/Ab reaction ① Ag : 면역반응을 일으킬 수 있는 물질 ② Ab : 면역반응의 산물 [Ag-Ab 반응 ] → 한 종류의 Ab 는 한 종류의 Ag 만 반응한다. ex) Anti insulin Ab 는 오직 insulin Ag 만 반응한다. 따라서 여러 단백질 중에서 내가 원하는 Ab 를 이용하면 원하는 단백질의 유무를 확인할 수 있다.  1 st Ab 는 target protein 만 reaction  2 nd Ab 는 1st Ab 만 target protein 으로 인식 후 reaction

4 1. Gel holder cassette 2. Holds the gel 3. Membrane 4. While fiber pads and filter paper 5. On both sides provide complete contact within the gel sandwich 6. The gel cassette is inserted vertically into the buffer tank. 3.Principal of western blot

5 5 Transfer Transfer

6 Detection

7 7 ① kit - SDS PAGE gel - Nitrocellulose membrane - Western Transfer Kit ② buffer - Western Transfer Buffer : 25mM Tris-Cl, pH 8.3, 1.4% glycine, 20% methanol - TBS-T Buffer : 10mM Tris-Cl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20 - 1st-Ab( Histidine IgG) - 2nd-Ab(Goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase ) - NBT / BCIP solution - AP Buffer(pH 9.5) ▶ material 4.Western blot material & protocol

8 ▶ protocol ① Western blot transfer : 250mA, 30min ② 5% non fat milk : 1hr ③ TBS-T washing : 5min Ⅹ 3 ④ 1 st Ab reaction : 1hr ⑤ TBS-T washing : 5min Ⅹ 3 ⑥ 2 nd Ab reaction : 30min ⑦ TBS-T washing : 5min Ⅹ 2 ⑧ HRP detection : 10min

9 ① ② ③ 1.Transfer 2.Ab reaction 3.Detection 5.Western blot 의 전체적 전략