Competent Cell. Competent Cell? DNA 를 받아들일 수 있는 능력을 가진 cell 효과적으로 Transformation 하기 위해 정상 의 Bacteria cell 에 물리적, 화학적 처리를 가하여 외부의 DNA 가 잘 들어갈 수 있도록 만든.

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1 Competent Cell

2 Competent Cell? DNA 를 받아들일 수 있는 능력을 가진 cell 효과적으로 Transformation 하기 위해 정상 의 Bacteria cell 에 물리적, 화학적 처리를 가하여 외부의 DNA 가 잘 들어갈 수 있도록 만든 cell

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4 Competent Cell 종류 JM109 : Greatly improving the quality of miniprep DNA, and improving insert stability. DH5α : Commonly used strain in the world, especially for general cloning procedures. BL21(DE3) : All-purpose strains for high- level protein expression.

5 Competent Cell 제조방법 1. Electroporation method - 세포에 전기 충격을 가해 발생하는 High Field Strength 로 인해 DNA 가 세포 안으 로 전달되는 방법. - 강한 전기적 충격으로 인해 순간적으로 membrane 이 깨져 생성된 구멍을 통해 DNA 가 Cell 로 들어감.

6 Competent Cell 제조방법 2. Chemical Treatment Method - CaCl 2 Method * - RbCl 2 Method * - Ultra Competent Cell (Inoue Method)

7 CaCl 2 treatment Positive charge of Ca 2+ ions neutralizes: Negative charge of DNA phosphates Negative charge of membrane phospholipids Ca 2+ 은 cell membrane 의 유연성을 떨어지게 하며, 그 때 생기는 틈새 로 외부의 DNA 가 cell 내부로 들어 가는 기회를 만들어 준다.

8 Method 1. Pick a single colony and inoculate 2ml of LB. Grow overnight at 37°C. 2. Add 1 ml overnight culture to 100 ml prewarmed LB medium in a 250 ml flask, and shake at 37°C until an OD600 of 0.5 is reached (approximately 90–120 min). 3. Cool the culture on ice for 5 min, and transfer the culture to a sterile, round-bottom centrifuge tube. 4. Collect the cells by centrifugation at low speed (5 min, 4000 x g, 4°C). 5. Discard the supernatant carefully. Always keep the cells on ice. 6. Resuspend the cells gently in cold (4°C) TFB1 buffer (30 ml for a 100 ml culture) and keep the suspension on ice for an additional 90 min. 7. Collect the cells by centrifugation (5 min, 4000 x g, 4°C). 8. Discard the supernatant carefully. Always keep the cells on ice. 9. Resuspend the cells carefully in 4 ml ice-cold TFB2 buffer. 10. Prepare aliquots of 100–200 μl in sterile microcentrifuge tubes and freeze in liquid nitrogen or a dry-ice–ethanol mix. Store the competent cells at –70°C.

9 Caution  Cell 은 OD600nm 에서 0.5 값을 넘기지 말 것.  시약처리 과정 및 모든 과정에서 항상 온도 변화에 신경을 쓸 것.  주어진 시간을 잘 지키고 pipetting 할 때 천천히 조심스럽 게 할 것.  Contamination 에 주의 할 것.

10 Buffers for preparing competent E. coli TFB1: 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2 30 mM potassium acetate 10 mM CaCl2 15% glycerol pH 5.8* sterile-filter TFB2 : 10 mM MOPS 10 mM RbCl 75 mM CaCl2 15% glycerol adjust to pH 6.8 with KOH, sterile filter

11 Competent Cell 의 이용

12 Transformation (genetics) Transformation ; DNA 를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정 CellDNATerm Prokaryote Plasmid Bacteriophage (virus) Transformation Infection Eukaryote Plasmid Virus vector Transfection

13 Transformation 의 원리 E. coli cell 이 DNA 를 uptake 할 수 있는 상태 (competent) 로 만들어 주기 위해 E. coli cell 을 Ca ++ 과 같은 multivalent ion 의 존재 하에 0 o C 에서 incubation 한다. 이때 E. coli cell membrane 에 존재하는 lipid 의 negatively charged phosphate 와 complex 를 이룰 것으로 추정된다. 낮은 온도는 cell membrane 을 응고시켜 charged phosphate 의 분포를 안정화하여 효과적으로 shield 되게 하여준다. 이때 37~42 o C 로 heat shock 를 가하면 E. coli membrane 내외의 thermal imbalance 가 생겨 DNA 가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다.

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16 Method 1. Com. cell 에 DNA 1ul 를 넣는다. 2. tapping 후 ice 에 5 분 incubation. 3. 42 ℃ 에서 1 분 30 초간 heat incubation. 4. 즉시 ice 에 5 분 incubation. 5. LB plate 에 spreading. 6. 다음 날 오전 결과 확인.

17 Transformation