7. Cloning vectors for eukaryotes

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1 7. Cloning vectors for eukaryotes

2 효모 Saccharomyces cerevisiae 3-4 μm

3 Life cycle

4 Yeast plasmid vector Base plasmid: 2 μm plasmid
특징: self replicating plasmid high copy plasmid: 70~200 copies/cell 필요 요소: ori: replication origin REP1,2: 딸세포로 균등하게 전달되게 함 FLP: DNA 재조합관련 유전자 종류 1. YEP: yeast episomal plasmid 2. YIP: yeast integrative plasmid 3. YAC: yeast artificial plasmid

5 선택 배지 선택 표식자; 아미노산 생합성에 포함되는 효소에 대한 유전 암호
LEU2; pyruvic acid을 leucine으로 전환하는데 포함된 효소 중 하나인 β-isopropyl malate dehydrogenase에 대한 유전 암호 숙주는 비기능성 LEU2 유전자를 가진 영양요구체 돌연변이 (auxotropic mutant) 선택 배지

6 - 특징: bacterial plasmid같이 독립적으로 존재
YEP vector - 특징: bacterial plasmid같이 독립적으로 존재 Key element: 1. 복제원점 두가지:shuttle vector pBR322 Ori- rep in E. coli 2um ori – for rep in yeast 2. selection marker for bacteria- amp or tet저항성 마커 for yeast: His3, Leu2, Ura3중 3. multi-cloning site

7 Yeast selection 방법: amino acid 합성결핍 균주 사용

8 2) 기타 Yeast vector - YIP (yeast integrative plasmid):염색체에 삽입용 - YRP (yeast replicating plamid): ARS 가 독립적 복제 - YCP (yeast centromere plasmid): ARS와 CEN ori 포함 single copy plasmid형태로 유지

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10 3) 효모 인공염색체 - yeast artificial chromosome: YAC vector 구성요소: 1. bacterial Ori, Amp 2. yeast - ARS and CEN: 복제원점, 1 copy - Telomere - selection marker: TRP1, URA3 - 삽입마커: SUP4 보유-재조합시 흰색콜로니 형질전환: Yeast spheroplast 제조  형질전환

11 YAC vector 클로닝 과정: up to mega base

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13 Agrobacterium tumefaciens; 많은 종의 쌍자엽식물에 근두암종
고등식물의 클로닝 벡터 Agrobacterium tumefaciens; 많은 종의 쌍자엽식물에 근두암종 Crown gall disease을 일으키는 토양 미생물 Agrobacterium rhizogenesis

14 Ti tumor inducing 플라즈미드
200 kb 분자의 일부분 T-DNA kb 식물 염색체 DNA 삽입

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17 복수벡터 전략 binary vector strategy
동시삽입 전략 cointegration strategy T-DNA 모든 암유전자 disarming 감염성 virulence region 에 의해 통제 왼쪽, 오른쪽 경계 두개의 25 bp 반복 염기 배열 복수벡터 pBIN19

18 Binary vector First step: Integration of foreign DNA (green) into a Ti plasmid without virulence genes (vir genes). This vector is propagated in E.coli bacteria. Second step: The two plasmids are joined together in an Agrobacterium strain. Third step: The T-DNA is transferred to plant cells. The Agrobacteria and plant leaf pieces are cultivated together, followed by regeneration. The untransformed cells are selected with the help of the marker gene. Diagram: Agrobacterium-mediated transformation using binary vectors

19 Ri 플라즈미드 Rhizogenes 단자엽 모근 질병; hairy root disease 쌍자엽 토마토, 담배, 감자, 완두, 애기장대 단자엽, 밀, 보리, 벼, 옥수수

20 플라즈미드 DNA를 직접 식물체 배에 도입 biolistics Bombardment with microprojectiles

21 1984년 초나선형 박테리아 플라즈미드가 식물 염색체에 재조합
삽입; biolistics 고분자 음이온 화합물에 의해 원형질체 표면에 DNA를 침전시키고 Endocytosis에 의해 DNA 도입 유도하는 polyethylene Glycol 의 점성 용액에 녹여진 원형질체를 이용 DNA를 함유한 리포좀과 원형질체 융합 세포벽 재생을 도와 주는 용액에 원형질체 방치 선택배지에 평면 배양 형질전환체 확인

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23 식물 바이러스를 클로닝 벡터로 사용하는 시도 Caulimovirus 벡터 Cauliflower mosaic 바이러스 유전체 (CaMV) 유전체 크기 제한, 숙주 제한 순무, 양배추, 꽃 양배추 같은 소수 십자화과 식물에 클로닝 Geminivirus 벡터 옥수수 밀 숙주 단자엽 식물체를 위한 잠재적 벡터 감염 사이클 동안 geminivirus 유전체가 재배열, 삭제 단점

24 곤충에서의 클로닝 벡터 초파리 Drosophila melanogaster Thomas Hunt Morgan 1910년 초파리 클로닝 벡터 P 엘리먼트 P element; transposon 2.9 kb 세 유전자 양쪽 끝에 짧은 역반복 염기서열 이동 즉 트렌스포지션 과정을 수행하는 트렌스포존 에이즈를 코딩 두개의 P 엘리먼트 하나는 원하는 DNA 넣는데 새로운 DNA 삽입은 트렌스포존에이즈의 코딩을 망가지게 한다 두번째 엘리먼트는 역반복 염기가 소실되어 트렌포존에이즈가 인식하지 못하여 초파리 염색체로 이동되지 않는다 벡터를 초파리 배아에 주사

25 Baculovirus life cycle
Use: Production of recombinant glycoproteins

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27 포유류에서의 클로닝 유전자 넉아웃 gene knock-out 쥐와 같은 설치류 포유동물 세포에서 재조합 단백질 생산 가축의 우유 ed에서 제약에 사용되는 중요 단백질 생산 인체 질환 치료에 사용되는 유전자 치료 gene therapy 1979년 simian virus 40 SV40 에 근거한 벡터 어떤 숙주 활성적 lytic cycle 어떤 숙주 비활성적 lysogenic cycle 5.2 kb 2 종류 감염직후에 발현되어 바이러스 DNA 복제에 관여하는 초기유전자 바이러스를 감싸는 켑시드 단백질을 발현하는 후기 유전자 문제점; DNA크기 제한 후기 유전자 (캡시드 단백질 생산) 제외 Adenovirus; SV40 보다 큰 DNA 조각 삽입 Papillomavirus; 상대적으로 큰 DNA 조각을 넣을 수 있고 안정성 있게 클로닝된 유전자를 발현하는 세포주를 만든다 레트로바이러스 retrovirus ; 포유류 세포 클로닝에 가장 많이 사용 벡터없이 하는 유전자클로닝 1990년대 초반 포유류 세포에 유전자 DNA 직접 주입 방법 개발 박테리아 플라즈미드 또는 직선형 유전자 분자들을 포유세포 핵에 직접 주입하여 DNA가 염색체에 껴들어 가게 하는 것

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