1 Clinical Biochemistry Lab. College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science SDS-PAGE gel making Clinical chemistry experiment.

Presentation on theme: "1 Clinical Biochemistry Lab. College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science SDS-PAGE gel making Clinical chemistry experiment."— Presentation transcript:

1 1 Clinical Biochemistry Lab. College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science SDS-PAGE gel making 130601 Clinical chemistry experiment

2 2 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  SDS-PAGE gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) –Protein analysis (separating by protein size)

3 3 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  SDS-PAGE gel Sodium dodecyl sulfate (SDS) –Most widely used PAGE protein separation technique –Protein net charge → negative charge HydrophobicHydrophilic

4 4 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  SDS-PAGE gel Poly acrylamide –Acrylamide : bis-acrylamide = 29 : 1

5 5 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  SDS-PAGE gel Stacking gel & Running gel –Stacking gel : 1.0M Tris-HCl (pH 6.8) –Running gel : 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) –Cl -, glycine (pI 6.2) Velocity of protein –Stacking gel (pH 6.8) Cl - > protein > glycine –Running gel (pH 8.8) Cl - > glycine > protein

6 6 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Materials Solution –Acrylamide 30% mix (29:1) –1.0M Tris-HCl (pH 6.8) –1.5M Tris-HCl (pH 8.8) –10% sodium dodecyl sulfate (SDS) –10% Ammonium persulfate (APS) –Tetramethylethylenediamine (TEMED) –Autoclaved distilled water (autoclaved D.W.)

7 7 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Methods Glass plate 준비 –1.0 mm spacer plate 1 장, short plate 1 장 ( 깨지지 않도록 주의 ) –70% ethanol 과 kimwife 로 plate 를 닦음 Casting frame 에 plate 를 고정 Casting stand 에 casting frame 를 고정 –D.W. 을 plate 사이에 넣어 세는 곳이 없는지 확인 –D.W. 를 kimwife 를 이용하여 제거 –3M paper 를 이용하여 완전히 제거

8 8 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Methods Running gel solution 을 만든 후 plate 에 분주 –10ml conical tube 를 준비하여 solution 을 만듬 – 조성표에 따라 용량이 맞도록 conical tube 에 분주 –Voltexing –1000p pipette 으로 plate 에 적정용량 (3-4ml) 분주 –D.W. or Isopropanol 을 running gel 위에 분주하여 기포 제거 –15min 이상 방치하여 gel 을 굳힘 –Running gel 이 다 굳으면 D.W. or Isopropanol 제거

9 9 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Methods Stacking gel solution 을 만든 후 plate 에 분주 –10ml conical tube 를 준비하여 solution 을 만듬 – 조성표에 따라 순서와 용량이 맞도록 conical tube 에 분주 –Voltexing –1000p pipette 으로 plate 에 적정용량 (1-2ml) 분주 –10-well comb 을 꽂음 ( 기포가 생기지 않도록 주의 ) –15min 이상 방치하여 gel 을 굳힘 –Stacking gel 이 다 굳으면 comb 를 제거

10 10 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Methods Washing & Storage –D.W. 로 washing 후 3M paper 로 물기 제거 –Casting stand, casting frame 을 제거 –Plate 주변의 붙은 이물질 제거 –Wrap 과 kimwife 를 이용하여 gel 을 포장 –4’C 냉장고에 보관

11 11 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Caution 반드시 비닐장갑을 착용하고 실험할 것 –Acrylamide solution, poly-acrylamide gel –TEMED TEMED – 생선 썩은 냄새가 나는 발암물질 – 휘발성이 있으므로 호흡으로 인한 흡입이 되지 않도록 주의 Acrylamide –Neurotoxin ( 신경독 )

12 12 College of Health Science, Department of Biomedical Laboratory Science  Caution 차분한 자세로 실험에 임할 것 –Solution 이 담긴 tube 의 cap 이 닫혔는지 항상 확인 –Pipetting 시 주의 Over-flow 주의 Tip 이 다른 사람의 몸이나 자신의 몸에 닿지 않도록 할 것 –Glass plate 를 다룰 때 주의 Short plate 는 매우 쉽게 깨지므로 충격을 주지 않도록 주의 Washing 시 sponge 의 부드러운 면으로 닦아냄