녹용의 분자 마커(DNA marker)를 이용한 사슴 종판별 기술

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1 녹용의 분자 마커(DNA marker)를 이용한 사슴 종판별 기술
지노첵㈜ 경희대학교 한의과대학 전북대학교 수의과대학 한양대학교 분자생명과학부 퓨리메드 ㈜ 배 현 수(OMD, Ph.D.)

2 개 요 녹용 국내 시장 2,000 억원 (세계 시장의 80%) 신원장과 한의유통사업단과 법정 싸움
2006년 9월 MBC PD 수첩 < 한의학 미스터리, 녹용 > 엘크(북미산) 밀수로 인한 CWD 위험에 노출

3 지역별 녹용 생산 현황 PD수첩, 국내유통 러시아 녹용의 절반은 가짜 엘크 (북미) 원용 (러시아) 깔깔이 (중국) 뉴자
(뉴질) PD수첩, 국내유통 러시아 녹용의 절반은 가짜

4 사슴의 분류 이름 학명 이명 유통명 생약 규격집 발췌 매화록(梅花鹿) Cervus nippon
sika deer, Japanese deer 화용, 꽃사슴 마록(馬鹿) Cervus elaphus 적록(red deer) (뉴질랜드)뉴자 (러시아) 원용 (Cervus elaphus sibericus) (중국) 깔깔이(Cervus elaphus Bartrianus) 대록(大鹿) Cervus canadensis elk, wapiti 엘크(수입금지) 생약 규격집 발췌

5 ZOOLOGICAL SCIENCE Vol. 19 (2002) , No. 4 pp Molecular phylogeography of the red deer (Cervus elaphus) populations in Xinjiang of China: comparison with other Asian, European, and North American populations.

6 ZOOLOGICAL SCIENCE Vol. 19 (2002) , No. 4 pp Molecular phylogeography of the red deer (Cervus elaphus) populations in Xinjiang of China: comparison with other Asian, European, and North American populations.

7 Molecular Phylogenetics and Evolution
Vol. 22, No. 3, March, pp. 342–356, 2002 A phylogenetic comparison of red deer and wapiti using mitochondrial DNA

8 Molecular Phylogenetics and Evolution
Vol. 22, No. 3, March, pp. 342–356, 2002 A phylogenetic comparison of red deer and wapiti using mitochondrial DNA

9 녹용 종판별 국내외 연구현황 구분 수행기관 내용 활용 국내 서울대학교천연물과학연구소
녹용절편의 기원동물 감별을 위한 분자 마커 개발 순록을 구별하는 지표를 제공 대구한의대학교 1. RFLP를 이용한 사슴의 품종 식별 2. 파이로시퀀싱을 이용한 사슴의 품종 식별 특허등록 한국한의학연구원 multiplex-PCR을 이용한 사슴의 품종 식별 방법 특허 등록 국외 Alberta 대학(캐나다) 미토콘드리아 DNA에서 적록과 와피티(wapiti)의 계통 비교 사슴의 종에 따른 계통 관계를 제시

10 녹용 종판별 국내외 연구내용 대부분 mitochondrial DNA (mt DNA)분석
적록과 wapiti의 mt DNA의 차이 5.6% mt DNA중 D-loop부분 연구가 사슴 종 분류에 가장 많이 사용됨 적록과 wapiti의 D-loop 상동성 97% 7.8kb tRNA rRNA NADH Hydrogease 1 (ND1) ND2 CO1 CO2 ATPase 8 ATPase 6 CO3 ND3 ND4 ND5 ND6 CytoB D loop Cervus elaphus mtDNA sequences (AB245427) 15.3kb 6.8kb 5.3kb 14.1kb 8kb variable region

11 국내에서 연구 되어지는 대부분의 사슴 종판별 방법은 분석의
녹용 종판별 관련 기술의 장단점 Restriction Fragment Length Polymorphism (RAPD) - 집단유전학자들이 사용한 최초의 DNA 분자 마커임. DNA를 제한효소로 자르고 전기영동을 한 다음 탐침(probe) DNA를 이용하여 서던블롯팅하여 변이를 관찰한다. 하지만 서던 블롯팅에 많은 시간과 돈이 소모된다는 단점이 있으며, 재현성이 떨어지는 문제점이 있음. Random Amplified Polymorphic DNAs (RAPDs) - 매우 짧은 프라이머(10bp정도의 길이)를 이용하여 PCR 증폭을 하고 이 결과를 전기영동에서 확인하는 기법임. PCR 조건에 매우 민감하여 반복실험 시 동일한 밴드 패턴을 얻기가 힘듦. Pyrosequencing - 속도와 정확도가 개선된 시퀀싱기법이나, 숙련자와 기기 및 비용이 높다는 단점이 있음. Multiplex-PCR - 동일한 reaction 에서 둘 이상의 amplicon을 증폭하는 방법으로 정확도와 시간의 단축의 장점이 있으나, primer 들간의 간섭으로 . Mono PCR에 비해 감도가 낮음. 국내에서 연구 되어지는 대부분의 사슴 종판별 방법은 분석의 재현성 및 고비용 현상이 내재되어 있음.

12 퓨리메드의 분자마커를 이용한 녹용 종판별 수집된 녹용에 대한 종판별 관련 COA 작성
DNA 추출 PCR 녹용입수 결과 분석 수집된 녹용에 대한 종판별 관련 COA 작성 (현재까지 약 150건 이상의 COA 제작 경험)

13 퓨리메드 녹용 유전자 보유 현황 원용 꽃사슴 순록 뉴질랜드 중국 엘크 53(~150) 02 (계속 수집중)
09 (계속 수집중) 11 05 14 gDNA 보유(-70℃)

14 종판별 가능성이 있는 분자마커(ATPase8)

15 종판별 가능성이 있는 분자마커(ATPase8)

16 종판별 가능성이 있는 분자마커(ATPase8)
순록

17 종판별 가능성이 있는 분자마커(CO1) 순록 중국산 뉴질랜드산

18 종판별 가능성이 있는 분자마커(CO1) 중국산 순록

19 종판별 가능성이 있는 분자마커(CO1) 순록

20 퓨리메드 기술의 장점 Barcode of life data system
Barcode of life (국제생물바코드컨소시엄)에서 COI 유전자를 기반으로 동물 종 판별 표준으로 채택 전세계 30개국 145 여개 기관의 컨소시엄 / 2007년 3 만종 이상을 진행한 상태임. Barcode of life data system

21 퓨리메드 종판별 기술의 응용성(DNA chip)
샘플확보 미토콘드리아 추출기술확립 염기서열 분석 TGCTCTTGAATCTTTTGATCATGCTGTG ...C C G ...C C T G ...C C G...A... ...C C G...T..... A G.... Probe 선정 DNA chip 검증 Wrong New DNA chip 시제품제작 유통되는 녹용샘플 및 보완 녹용 종판별 제작 DNA chip의 가장 큰 장점은 기존에 사용되었던 Southern과 Northern blot, 돌연변이 검색 그리고 DNA sequencing 방법들보다 훨씬 짧은 시간에 적은 시료를 가지고 많은 종류의 유전자를 검색할 수 있다는 것이며, 결과에 대한 제현성이 상당히 높음. 또한 대량생산시 분석비용 절감효과가 큼.

22 녹용 종판별 DNA chip 모식도

23 녹용 종판별 DNA chip의 프로토콜 type probe1 probe2 원용 ● 엘크 중국산 순록 뉴질랜드 type probe1 probe2 probe3 원용 ● 엘크 중국산 순록 뉴질랜드 Probe1과 probe2에서 구분이 가능한 종은 probe 1, 2 만 사용하여 구분함 Probe1, 2로 구분이 힘든 경우, Probe 3 사용하여 구분함

24 DNA chip 결과 중국산 CO1 CO1 공통 Position 중국산 ATPase 중국산 CO1 probe 중국산
ATPase probe CO1 공통 probe

25 DNA chip 용 탐침(Probe) CO1 ATPase 제거된 probe 첨가된 probe 중국산 CO1-C-1-S 순록
CO1-R-6 CO1-C-1-AS 꽃사슴 CO1-F-1 CO1-C-1-AS-2 CO1-F-2 CO1-C-2 CO1-F-2-1 CO1-C-3 CO1-F-3 뉴질랜드 CO1-N-1 원용/엘크 CO1-E-1 CO1-N-1-1 CO1-E-2 CO1-N-2 CO1-E-3 CO1-N-2-1 공통 CO1-P.C-1 CO1-R-1 CO1-P.C-1-AS CO1-R-2 CO1-P.C-1-AS-1 CO1-R-3 CO1-P.C-2 CO1-R-4 CO1-P.C-3 CO1-R-5 CO1-P.C-4 ATPase 중국산 ATPase-C-1 엘크 ATPase-E-1 ATPase-C-2 ATPase-E-2 ATPase-C-3 ATPase-E-3 ATPase-C-4 꽃사슴/엘크/원용 ATPase-F/E/S-1 뉴질랜드 ATPase-N-1 ATPase-F/E/S-2 ATPase-N-1-AS 엘크/원용 ATPase-E/S-1 ATPase-N-2 ATPase-E/S-2 ATPase-N-2-1 순록 ATPase-R-4 ATPase-N-3 ATPase-R-5 ATPase-N-3-1 ATPase-R-6 제거된 probe 첨가된 probe

26 Thank You !