7장. DNA에 의한 세포의 형질전환 유전공학.

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1 7장. DNA에 의한 세포의 형질전환 유전공학

2 형질전환의 단계

3 Transformation

4 형질전환 과정

5 Cloning 의 목적 제한된 양의 시발물질(목적의 DNA)로부터 많은 양의 재조합 DNA 분자를 생산할 수 있다 ng의 DNA → ug(1,000배) → mg(100만 배)의 재조합 DNA 획득) 유전자의 구조, 기능, 발현 등에 이용. 정제된 재조합 DNA 분자만을 얻을 수 있음. 결합되지 못한 운반체 분자 제거. 결합하지 못한 DNA 단편 제거(exonuclease). Recycling 된 운반체 DNA의 제거. 원치 않은 DNA 단편이 결합된 재조합 DNA. 정확한 재조합 DNA만을 획득. *** Cloning: 재조합 DNA 분자를 만드는 것 만을 의미하는 것이 아니라, 재조합 DNA 분자를 숙주세포에 도입하는 형질전환 까지를 의미함.

6 Cloning에 의한 재조합 DNA 생산

7 Transformation의 개념 Transformation(형질전환) 외래 DNA를 숙주세포 내로 주입하여 숙주의 형질을 바꾸어 주는(전환시키는) 현상 *** Exo, Endo-nuclease에 의해 분해될 수 있음. 자연계에서 잘 일어나지 않음(제한된 양). Bacillus, Streptococcus의 종류에서 일어남. Transformation(형질전환), Infection(바이러스 감염), Transfection(형질감염)의 차이점.

8 세 가지 용어의 차이점 Host Cell DNA Term Procaryote plasmid
Transformation, Infection, Transfection의 차이점. Host Cell DNA Term Procaryote plasmid Bacteriophage(virus) Transformation Infection Eukayote Virus vector Transfection

9 Transfection 방법 Chemical Method. Calcium phosphate 이용법. Liposome 이용법.
Physical Method. Electroporation. Microinjection. Virus 이용법. Retro virus 이용 Adeno virus 이용. Adeno associate virus 이용.

10 형질전환 발전 단계 1970. Mandel and Higa 형질전활 율 증가 Ice-cold CaCl2 solution(⋋ phage). 1972. Cohen et al plasmid DNA transformation 성공. 1978. Kushner 가 양이온(+ 2)과 DMSO 이용. 1983. Hanahan Hexamine cobalt chloride.

11 Competent cell 이란? 정상적인 세균세포(Bacterial cell)에 화학적 처리를 하여 외래 DNA가 세균세포(숙주세포)에 잘 들어가게 제조된 세포(형질전환 허용 세포 또는 수용성 세포). 화학적 처리에 사용하는 시약 Calcium chloride, Hexamine cobalt chloride, Manganase chloride, Di methyl sulfoxide(DMSO). Calcium chloride가 가장 많이 이용된다. Amp sensitive(Amp-), Tet sensitive(Tet-).

12 Transformation 과정 CaCl2로 세균 세포 처리. Competent cell 제조. plasmid DNA add.
Heat shock.

13 Transformation 과정

14 형질전환 결과 Competent cell (Amps , Tets ) pBR322 add. Transformation.
Transforment (Ampr, Tetr) *PBR ng으로 1000 ~ 10,000개의 형질전환 체를 형성시킬 수 있음(형질전환 률 0.01%).

15 형질전환 및 형질전환 체 분리. 선택배지(Selective media): 항생제 배지 사용.

16 형질전환 과정. Ligation mixture(재조합 DNA). Competent cell에 add.
Heat shock(42℃) LB(Luria Bertani) 배지에 접종 후 배양. 37℃ 1~2hrs(재조합 DNA 유전자 발현). Selective media(항생제 배지)에 접종 후 배양. 37℃ 16~18시간 배양. Transforment 분리.

17 유전자 발현 및 pBR 322 vector.

18 불활성화한 pBR 322 재조합체의 선발 복사 평판 법(Replica method)

19 pUC 8 plasmid DNA. 삽입에 의한 불활성화를 이용한 운반체 DNA.
Lac z’ gene(β-galactosidase) 보유. Amp 저항성 유전자 함유.

20 Lac z’ gene의 기능 Β-galactosidase를 생산. Lactose를 glucose와 galactose로 분해.
IPTG 존재 하에 X-gall을 분해하여 Blue colony 형성함. X-gall: Lactose와 유사한 물질 bromo-4chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside. IPTG: Isopropyl Thiogalactosidase 효소유도체로 X –gall 반응을 촉매 시킨다. lac gene에 목적의 유전자 삽입(재조합 DNA)으로 White colony(B - galactosidase 생성 못함) 생성.

21 pUC8 lac z’(형질전환 체 분리)

22 Transfection(형질감염) 시험관 내 봉합(in vitro packaging) 방법보다 비효율적임.
빠르고 간단함(장점). ⋋phage DNA + Object DNA. ↓ 재조합 ⋋phage. Competent Cell 에 add. ↓ 42℃ heat shock. Transforment isolation.

23 In vitro packaging(시험관 내 봉합)

24 In vitro packaging(⋋ phage )
⋋ genome에 암호화 되어있는 protein이 필요함. Coat protein, Tail protein, Head protein. Tail protein gene 손상된 ⋋phage Head protein gene 손상된 ⋋phage. 완전한 ⋋ DNA(재조합 DNA) 분자 형성.

25 In vitro packaging(⋋ phage )
Bacteria에 감염시킴. Lytic cycle 에 의해 plaque 형성. 손상된 ⋋phage는 plaque 형성 못함. Plaque assay를 이용하여 재조합 ⋋phage 를 선별할 수 있음(M13 phage: 불투명 plaque).

26 파지 Plaque

27 재조합 ⋋ 파지 선발방법. Lac z’ 유전자를 이용한 선발 재조합체 : 백색 plaque 형성 비 재조합체: 청색 plaque 형성. ⋋ cI gene 을 이용한 선발 재조합체 : 투명 plaque(cI 발현 억제) 비 재조합체 : 혼탁 plaque(cI 발현).

28 재조합 ⋋ 파지 선발방법. Spi 표현형을 이용한 선발 P2 phage 보유 : ⋋phage 감염 못함(Spi+). 재조합 phage : Spi+ → Spi-. ⋋ genome 크기에 의한 선발. ⋋ phage : 37 ~ 52 kb 크기(감염). 37 kb 이하, 52 kb 이상(비 감염).

29 재조합 파지 선발 방법

30 동식물세포에서의 형질전환

31 세균 이외의 형질전환 효모(Yeast): Saccharomyces cerevisiae. 식물세포 동물세포
Lithidium chloride. Lithidium acetate. 식물세포 Cell wall 분해(Cellulase, Chitinase). Electroporation 이용. 동물세포 Manipurator(Microinjection) 이용. Calcium chloride 이용.