조직의 고정 Tissue fixation.

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1 조직의 고정 Tissue fixation

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3 조직의 고정에 사용하는 화학물질을 고정제(fixing agent)
1. 의의 생체로부터 채취한 후에 조직표본 제작에 적합한 상태로 변화시키고, 원형 그대로를 유지시키는 것 조직에서 떨어져 나온 조직의 용해소체(lysosome)의 가수분해효소에 의해 자가용해(autolysis) 가 일어나고 그 후 미생물의 증식에 의해 부패(microbal putrefaction)가 일어난 형태와 구조의 변화 발생을 (사후변화 [postmortem change]) 막아 조직이나 세포를 살아 있는 상태와 같이 잘 보존된 형태를 유지하기 위한 과정 조직의 고정에 사용하는 화학물질을 고정제(fixing agent) 고정제를 어떤 용매에 녹인 용액 을 고정액(fixative)

4 II. 고정의 목적 생체 구성 조직이나 세포가 생체상태와 같이 잘 보존된 형태를 유지
사실상 조직을 생체로부터 채취한 후에 발생하는 ①자가융해(autolysis), ②화학물질의 용해 및 소실, ③미생물에 의한 부패 및 ④조직손상을 방지하여 생체 내에 있던 상태에 가능한 근접한 상태로 보존함 ⑤염색에 대한 매염 작용을 촉진시키기 위해 시행하고 있다. 1. 자가융해(autolysis)의 방지 고정에 의한 자가융해의 방지의 두 기전 첫째 ; 고정액의 작용에 의한 용해소체효소의 불활성화(inactivation)이고, 둘째 ; 용해소체효소가 작용하는 표적성분(target substances)을 화학적으로 변성시킴으로써 효소의 영향을 차단하는 것.

5 II. 고정의 목적 2. 조직 내 화학물질의 용해 및 소실 방지
가능한 살아 있는 상태와 유사하게 생체 그대로의 세포성분을 보호 - 단백질을 단단하게 보호(조직내 화학물질의 용해 및 소실방지) - 액체상의 조직성분을 불용화(경화, 단백응고) - 반유동체의 생체를 반고체의 경도로 전환(액체를 gel 상태로) 3. 미생물에 의한 부패방지 정상세균총(normal flora)에 의한 부패로 인한 조직의 변화 방지 4. 조직 손상의 방지 protein skeleton을 안정화시켜 조직의 변형이나 손상을 막아 준다. 5. 염색에 대한 매염작용 ; 염료의 촉진작용, 매염역할의 촉진 Massion’s trichrome 염색은 picric acid가 포함된 고정액에 고정 시 양호 - Masson’s trichrome stain (collagen) ; Bouin solution(picric acid) - PTAH stain (skeletal muscle) ; Zenker solution (HgCl2 [승홍] 포함 )

6 III. 고정제의 분류 고정제의 모든 작용은 주로 단백질과 관련된 것이다. 1. 고정제 분류 고정제의 모든 작용은 주로 단백질과 관련된 것 부가성 고정제(additive fixing agent) ; 단백질 분자 또는 작용기(reactive group)에 결합 즉, 분리되어 있는 단백질 분자사이에 가교를 형성하여 큰 단백질 분자를 형성 알데히드(aldehyde), 오스뮴산(osmium acid), 피크린산 (picric acid등 비부가성 고정제( non-additive fixing agent) ; 단백질 분자 또는 작용기(reactive group)에 결합하지 않음 에탄올(ethanol), 아세톤(acetone) 등 이 있다.

7 III. 고정제의 분류 응고성 고정제 ; 단백질을 침전 또는 응고시키는 것
단백질의 구조를 변형(denaturation)시켜 물에 용해되어 유실되지 않게 방지하는 것 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 아세톤(acetone), 피크린산(picric acid), 수은염(mercuric chloride) 비응고성 고정제 ; 단백질을 침전 또는 응고시키지 않는 것 알데히드(aldehyde), 오스뮴산(osmium tetroxide), 중크롬산칼륨 등 ※ 고정제의 화학적 특성 ; 기전(mechanism) aldehyde계 (예 : 포름알데히드 ; formaldehyde, 글루탈알데히드 ; glutaraldehyde)) ; 가교형성 산화제(예 : 오스뮴산, 중크롬산칼륨, 과망간산칼륨), 단백질 변성제(예 : 초산, 메탄올, 에탄올) 기타의 화학기전을 알 수 없는 것(예 : 염화제2수은, 피크 린산)

8 III. 고정제의 분류

9 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 포름알데히드 (formaldehyde, HCHO)
① 고정액의 제조법이 간단하고, 강한 살균력(방부제로 많이 쓰임) ② 다른 고정제에 비해 값이 싸면서도 ③ 빠른 조직 침투성과 뛰어난 고정효과 ④ 고정하면 조직의 색은 약간 회백색(혈액의 경우는 흑갈색)으로 변화 염색성에는 큰 영향을 미치지 않는다. ⑤ 전자현미경 검체의 고정 : paraformaldehyde (파라포름알데하이드)수용액 사용 →미세구조 보존에 우수한 효과 ⑥ 도은법을 이용한 염색법에 좋으며 점액질의 보호가 좋다. * 환기시설이 잘 된 곳에서 사용 - 갈색병에 보관

10 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 포름알데히드 (formaldehyde, HCHO) ⑦ 단백질을 변성(교차결합)
⑦ 단백질을 변성(교차결합) formalin을 장시간 보존할 경우 산소와 결합하여 산화가 되어 formic acid(개미산)를 형성 (pH가 산성으로 변한다.) 고정액 pH 7.0에서 고정효과가 크다. 산성에서 고정 시 염색성 약화 / 산화 방지 ; % Methanol 첨가 Hb와 결합, 갈색의 인공색소(formalin 색소)형성 고정액의 pH가 5.6이하로 낮아지면, 조직 내에 존재하는 적혈구를 용혈시켜 혈색소(hemoglobin)와 결합하여 갈색의 색소 acid hematin을 생성하는데 이를 포르말린색소( formalin pigment)라 부른다.

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12 Formalin pigment

13 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 포름알데히드 (formaldehyde, HCHO) Formalin 색소 제거법
① 카다세위치법(Kadarsewitch method) ; 70% ethanol + ammonium chloride 5분 ~ 4시간 처리 후 수세 ② 베로카이 법(Verocay method) ; 80% alcohol 100㎖ + 1% pot. Hydroxide 1㎖ 10분 간 처리 후 수세한 후에 80% 에탄올에 5분간 처리 후 수세 ③ Picric acid method ; picric acid alcohol saturated solution (70%)에 5~2시간 처리 ④ Lillie method ; 1% ammonium hydroxide

14 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 포름알데히드 (formaldehyde, HCHO)
⑧ conc formalin ; 37~40% formalin . ※ 포르말린 수용액을 고정액으로 사용하는 경우 ; 물 또는 완충액으로 10%가 되도록 희석하여 사용 포름알데히드가 37~40% 함유된 포르말린 원액을 100%로 간주하여 포르말린 원액 1 : 물 9의 비율로 희석한 %를 가리키는 것 10% 포르말린액이란 : 3.7~4.0%의 포름알데히드 수용액을 말한다. 10% neutral buffered formalin을 제조하여 사용하는 것이 좋다.

15 메틸렌 가교(methylene bridge) ;
IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 메틸렌 가교(methylene bridge) ; 단백질과 부가 또는 축합반응을 하여 폴리펩티드 사이에 메틸렌가교(methylene bridge) 가 생긴다 사슬 사이에 분자 내 또는 분자 사이 메틸렌가교(-CH2-) 를 형성하여 단백질을 고정한다

16 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 글루탈알데히드(glutaraldehyde, [CHO(CH2)3CHO])
분자량 100, 탄소수 5개의 곧은 사슬로 이루어진 디알데히드(dialdehyde)이다. 미세구조의 보존효과가 매우 우수하기 때문에 전자현미경 검사의 1차 고정. 전자현미 경용 검체의 고정 ; 1.5~4%의 0.05~0.1M 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.2~7.4)을 카코딜산염 완충액(cacodylate bufer, pH 7.2~7.4)에 희석하여 사용한다. 3. 사산화오스뮴 또는 오스뮴산 전자 현미경 검사의 2차고정액(postfixative)으로 사용 유독 가스 방출 (hood내에서 검사 시행) 생체막의 인지질 잘 보존 - 고정과 동시에 조직내 지질성분 검출

17 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 고정제, 염료로 사용되어지는 물질 4. 피크린산 (Picric aicd)
단순하게 사용되어지는 것보다 다른 고정제의 조성성분으로 많이 사용되어진다 Masson trichrome stain ; 매염제로 사용 (세포질의 염색성 ↑) 급속히 가열 시 폭발 위험성이 있다. 고정액으로는 포화수용액 사용 피크린산은 단독으로 사용하면 조직을 심하게 위축시키는 작용이 있기 때문에 보통 다른 고정제(예 : 포르말린, 초산, 염화제2수은 등)와 혼합하여 사용하고 있다. 예) 브앙(Bouin), 로스만(Rossman), 겐드레(Gendre), 드보스크-브라질(Duboscq-Brazil)액 등 브앙액 ; 아교섬유 염색 (Masson trichrome stain, van Gieson)에 우수 로스만과 겐드레액 ; 글리코겐 고정에 우수 드보스크-브라질액 ; 사구체모세혈관기저막 염색에 매염효과가 우수

18 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 알코올(alcohol) ① 에탄올(ethanol, C2H5OH)과 메탄올 (methanol, CH3OH)의 두 종류가 있으며 ② absolute ethanol은 glycogen, acid mucopolysaccharide 등의 보존이 좋고 , Nerve cell과 섬유 성분을 잘 고정시킨다. ③ 조직의 위축이 빠르게 이루어진다. ④ 고정, 탈수과정이 함께 이루어진다. 6. 아세톤( acetone, CH3COCH3) 고정, 탈수과정이 함께 이루어진다. Ethanol보다 심하게 위축이 이루어진다.

19 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 7. 염화제2수은 또는 승홍( mercuric chloride, HgCl2)
고정에는 흔히 포화수용액 상태로 사용된다. 다른 고정제(예 : 중크롬산 칼륨, 삼산화크롬, 초산, 삼염화초산, 포르말린 등)와 혼합 하여 사용 예) 젠커( Zenker), 헨리(Helly), 멕시모 우(Maximow), 하이덴하인 수사(Heidenhain susa), 사우딘 (Schaudinn)용액 등이 있다. 젠커액은 결합 조직염색(특히, PTAH)의 매염과 염색질 보존에 우수하다. 수은이온 ; 단백질의 카르복실기나 하이드록실기, 핵단백질의 인산기와도 반응한다. 이 화합물로 고정된 조직은 모두 수은염의 침전물 즉 금속성 수은 또는 승홍(HgCl)으로 된 결정상 흑색입자가 침착되기 때문 에 이른바 탈승홍과정( 요오드화)을 거쳐 제거해야 한다. 승홍이 함유된 고정액을 취급할 때 금속제 기구를 사용하면 착염을 형성하여 침전물이 발생 하므로 초자류나 목제기구를 사용하여야 한다.

20 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 7. 염화제2수은 또는 승홍( mercuric chloride, HgCl2) ※ 승홍으로 고정시 수은 색소 제거법 - 수은 색소 침착 시 염색성 결여되므로 염색 전 제거 되어야함 - 옥도화(iodized)과정을 거쳐야 함 - 제거 방법 ① iodine으로 수은색소를 제거한다. ② Sod. thiosulfate(Hypo용액)으로 잔여 iodine을 제거한다. 수은 색소 + Iodine →Mercuric iodine 생성 Iodine(갈색) + Sodium thiosulfate →무색

21 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 8. 중크롬산칼륨
8. 중크롬산칼륨 조직의 침투성이 느려 단독으로는 거의 사용되지 않고 복합 고정액의 한 성분으로 첨가된다. 중크롬산칼륨이 함유된 고정액 크롬친화성조직(chromaffin tissue), 골지체, 유사 분열상, 적혈구 등의 보존에 우수한 효과. 단점 ; 박절 시 조직이 잘 부스러지며, 멜라닌색소가 표백되고, 글리코겐이 잘 보존되지 않는다. 9. 초산( acetic acid, CH3COOH) 고정제로 항상 무수 상태 인 빙초산(glacial acetic acid)이 사용된다. 피크르산이나 승홍 과 같이 조직 위축성이 강한 고정제와 혼합하여 사용한다 반드시 후두(hood) 안에서 사용해야 한다.

22 IV. 고정제의 화학적 특성과 고정작용 10. 황산아연(ZnSO4) 화학적 재해와 관련성이 없고 조직 항원성의 보존이 우수하여 보통 항원부활 과정이 필요치 않다는 이유 때문에 지난 10년 수은 대체 고정제로 인정

23 조성 ; pot. dichromate , sod. sulfate, mercuric chloride
* Zenker solution 조성 ; pot. dichromate , sod. sulfate, mercuric chloride 성 질 ;1) liver, connective tissue fiber, nuclei의 고정이 우수 2) 침투가 빠르고 비교적 무난한 고정 3) Trichrome염색에 우수한 결과 4) 오래 저장 가능 5) 승홍을 염색 전에 제거해야 한다. (H&E 염색시 핵염색 전) 6) 승홍(mercuric chloride)는 단독으로 거의 사용되지 않음. 7) 결합조직염색(PTAH)의 매염과 염색질 보존에 우수 8) 승홍 화합물로 고정된 조직 –수은염의 침전물 (결절상 흑색입자 침전) 따라서 탈 수홍과정(요오드화)을 거쳐 제거한다. 이때는 초자 기구를 사용한다. (금속제는 착염 형성)

24 침투력이 빠른 고정액 -- 신속 표본제작에 사용
* Canoy’s solution 침투력이 빠른 고정액 -- 신속 표본제작에 사용 염색체 보존력 좋다. 고정과 동시에 탈수진행 Acetic acid가 포함되어 있어 적혈구를 용해 시키므로 (chloroform, ethanol) 혈액성분이 많은 조직을 고정 시 사용 * Bouin’s solution 고환과 같이 연하고 섬세한 구조를 갖는 조직에 적합 Masson trichrome stain ; 매염을 위한 2차 고정제로 사용 BM 처리시 약간의 탈회효과

25 V. 고정액의 특성에 따른 분류 고정액은 각각의 구조나 세포 성분의 보존 상태에 따라 분류한다

26 VI. 고정법의 종류 고정방법 ; 화학적 방법 ; 담금고정, 관류고정, 주입고정, 증기고정
물리적 방법 ; 가열고정, 동결고정, 극초단파고정 1. 화학적 고정 1) 담금고정( 침수고정, immersion fixation) 조직괴를 고정액 속에 일정 시간 넣어 고정하는 방법 고정제의 침투속도 ; 고정온도가 낮으면 저하 예) 4% 글루탈알데히드를 4℃에서 고정하면 침투속도는 실온 고정보다 약 1/2~2/3 정도 지연 고정액을 진탕하는 것이 침투가 잘 된다. 고정제 침투속도에 영향을 미치는 조건 : ①조직 의 종류, ②고정시간, ③고정액의 농도, ④고정제의 용매 종류, ⑤삼투압 등

27 2) 관류고정( perfusion fixation)
조직괴 내부도 상당히 균일하게 고정을 유도할 수 있다. 동물의 큰 혈관이나 심장 속으로 삽입관(cannula)을 넣어 직접 고정액을 주입 즉 혈관을 통한 생체의 전신 또는 국소부위(특정 장기 등)를 고정하기 위한 방법이다. 3) 주입고정( infusion fixation) 주로 폐와 같이 공기가 들어 있는 장기를 고정할 때 이용 폐의 주기관지를 이용하여 약 30 cm 높이의 정수압을 이용하여 고정액을 주입하는 방법 기관지 내 주 입법( intra-tracheal injection)이라고도 부른다. 커다란 병변 관찰에는 적합하나 기도 내의 침출성 변화는 관찰할 수 없는 것이 단점이다

28 4) 증기고정( vapor fixation)
신선한 조직 속의 가용성 물질을 불용성 산물로 변화시켜 존재위치가 이동되지 않도록 고정하기 위해 휘발성 고정제(예 : 포름알데히드, 루탈알데히드, 사산화오스뮴, 에탄올 등) 를 증기 형태로 조직에 작용시켜 고정하는 방법 대상 ; 신선조직의 도말표본이나 절편 및 동결건조한 조직편 또는 조직절편

29 2. 물리적 고정 1) 가열고정( heating fixation) protein denaturation을 시켜 고정 , autolysis 위험 조직병리 분야에서는 거의 사용 안 함 2) 동결고정 ( freezing fixation) 동결건조법(freezing-drying), 동결치환법(freezing substitution) 조직화학분야 --조직을 가능한 생체상태에 가장 가깝게 보존하는 효과 ⓐ 침적법 ; 극저온의 액체(액체질소 , nitrogen gas)에 급속히 침적하여 동결 ⓑ 금속 접착법 ; 극저온의 상태인 금속 블록에 급속히 조직을 접착시켜 동결 ⓒ CO2 동결법이나 전자식 동결법 3) 극초단파 고정 (Microwave fixation) microwave oven, microwave processor를 이용 조직 고정

30 VII. 고정에 영향을 미치는 요인 1. 고정제의 침투율 시간의 경과에 따라 침투율이 감소하는 것 ;
세포막이나 먼저 고정된 부분의 단백질막이 고정액 확산을 저해하는 장벽(barrier)으로 작용하기 때문 고정제의 침투율 ; 최고(예 : 초산, 중크롬산칼륨, 에탄 올 등), 중등도(예 : 포르말린, 염화제2수은, 피크린산 등) 최저(예 : 글루탈알데히드, 사산화오스뮴, 삼산화크롬 등)의 3등급 formalin ≒ 1mm/hr

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32 VII. 고정에 영향을 미치는 요인 2. 조직의 크기 조직 검체는 길이, 폭, 두께를 갖는 삼차원의 입체
광학현미경용 조직 ; 한 변이 0.3~0.5 cm 또는 그 이하 전자현미경용 조직 ; 두께 0.05~0.1 cm 또는 그 이하 3. 고정온도 화학반응 속도는 온도가 10℃ 상승할 때 2배 내지 4배 증가 높은 온도에서 고정 ; - 고정제와 조직 내 물질의 화학반응 속도는 증가 - 조직 내에서 발생하는 자가융해의 화학반응 속도가 현저히 촉진 - 조직 내 물질 의 추출도 활발히 일어난다. 낮은 온도에서 고정 ; - 조직의 자가융해 속도가 억제되며 조직 내 물질의 추출 정도도 감소한다.

33 VII. 고정에 영향을 미치는 요인 3. 고정온도 검체를 고정할 때에는 가능하면 낮은 온도를 선택하는 것이 바람직하다.
- 전자현미경 검사의 경우는 2~4℃의 저온(냉장고) 에서 고정하는 것이 원칙이다. - 일반 조직학적 검체의 경우는 실온(18~20℃)에서 고정 4. 고정시간 조직에 따라 적당한 시간을 선택하여야 한다. 고정시간이 짧으면 ; 고정이 불충분하여 조직구조가 손상 또는 파괴되고 조직화학반응도 약화된다. 고정시간이 길면 ; 과고정 (over fixation) 상태가 되어 조직 내 물질의 추출이 발생하여 조직구조가 약화됨으로 인해 수축 또는 팽창하며 조직 화학반응도 질적 또는 양적으로 변화한다.

34 VII. 고정에 영향을 미치는 요인 5. 고정액의 pH 고정액의 수용액 pH ;
범위를 벗어난 고정액에 고정 시에는 조직세포의 구성물질이 용해, 파괴, 인공산물 생산 초래 위점막을 보존하기 위해 pH 5.5 정도로 조절. 전자 현미경 고정 시 완충액 사용해서 pH 고정 6. 고정액의 삼투압 고정액의 삼투압( osmotic pressure)은 조직의 미세구조에 큰 영향을 미친다. ※삼투압 조절 고장액(hypertonic solution) ; 세포를 위축시킴 등장액(isotonic solution) & 저장액 (hypotonic solution) : 세포를 부풀리게 만든다. 따라서 고정액의 삼투압은 약간의 고장액상태(400~450mOsm)를 유지해야한다.(미세구조보존)

35 VIII. 고정의 실제 1. 고정용기 조직괴의 크기를 감안하여 충분히 여유있는 크기의 입구가 넓은 용기를 사용한다.
2. 고정액의 양 일반적으로 고정하려는 조직편의 10~15배 정도가 필요 하다. 3. 조직편의 취급 - 조직편의 두께는 보통 5 mm 이하가 좋다. - 조직표면에 묻은 응고된 혈액이나 점액은 고정액의 침투를 방해하므로 생리식염수로 제거한 후 고정한다.

36 VIII. 고정의 실제 4. 고정시간 - 고정액의 종류와 조직괴의 크기에 따라 다르다.
- 포르말린 고정의 경우 작은 생검검체는 수 시간에서 12시간, 두께가 5 mm 이상 되는 조직괴는 24시간 정도 고정한다. 5. 고정의 촉진 ; 진탕, 감압, 가온 (60℃ 이하 ) 6. 고정의 완료 ; 고정된 조직은 회백색으로 불투명해지고 딱딱 해진 것 7. 고정 후 처리 ; 고정 이 끝난 조직을 당분간 그대로 보존

37 IX. 전시용 박물표본제작을 위한 고정 카이저링(Kaiserling) 방법 3단계로 나눠서 고정함(본래의 색 유지)
- Kaiserling sol I :1~5일 일반적인 고정, 고정효과 - Kaiserling sol II : 1~6일간 색 복원(80% Ethanol) - Kaiserling sol III : 영구보존목적 교육목적,전시목적으로 태아나 장기를 장시간, 영구보존할 때 사용. 2. 디치오네이트(dithionate) 방법 장기 퇴색의 원인이 산화에 있기 때문에 환원 제를 첨가하면 해결할 수 있다는 발상에서 발전한 것