조직배양기술 (Tissue culture technology)

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1 조직배양기술 (Tissue culture technology)
박 종 철 연세대학교 의과대학 의학공학교실 Jong-Chul Park Department of Medical Engineering, Yonsei University College of Medicine, Seoul, KOREA

2 조직배양 (Tissue culture) 정의 조직배양 세포배양 생체의 일부를 떼어내어, 적절한 배지를 포함한 배양기 안에서
생육시키는 기술 조직배양 기관배양 (Organ culture) 세포배양 (Cell culture) 세포배양 Monolayer culture : 부착 • 단층 배양 Suspension : 혈액계 세포

3 세포 및 조직배양에 필요한 기기 무균실 • Clean bench 멸균기 (Autoclave)
배양기 (CO2 incubator) 증류수 제조장치 (DW • DI) 원심분리기 (세포분리 : 500 ~ 3,000 rpm) 현미경 (도립현미경) Glass ware : Pipettee (Mass, Pasteur), Flask, Bottle, Centrifuge tube … Plastic ware : Petri dish, Well plate …

4 멸균법 (Sterilization methods)
종별 방법 내용 가열법 가스법 조사법 약액법 여과법 고압증기법 건열법 방사선법 자외선법 고주파법 115°C (30분) 121 °C (20분) 126°C (10분) 135 ~ 145°C (3 ~ 5시간) 160 ~ 170°C (2 ~ 4시간) 180 ~ 200°C (0.5 ~ 1시간) Ethylene Oxide 60Cr 또는 137Cs의 γ-ray 전자선 파장 254nm 주파수 915 or 2450kHz Ethanol (70%), Phenol Pore size 0.2 or 0.45um

5 세포 및 조직 배양용 배지 배양세포 : 종속영양체 (Heterotroph) 배지의 조건 배지 제조용 증류수 : DI & DW
세포증식에 필요한 영양분, 미량성분 (일반적으로 혈청과 같은 천연물 첨가) 배지 제조용 증류수 : DI & DW 배지의 종류 천연배지 (Natural media) 혈장 (plasma) 혈청 (serum) : Lot No.에 따라 차이 큼 Yeast extract Bacto-pepton, skim milk 부착인자 (fibronectin, collagen)

6 세포 및 조직 배양용 배지 배지의 종류 합성배지 (Synthetic media)
MEM, RPMI 1640, Ham’s F-10, F-12 등 증식배지 (Growth media) 세포의 영양요구성, 실험내용, 가격, 입수 용이성 일반적으로 FBS 또는 CS를 5 ~ 10% 첨가 부착성 세포 : MEM, Ham’s F-12 부유계 세포 : RPMI 1640 유지배지 (Maintenance media) 증식은 안하며, 세포의 대사 유지가 필요한 경우 혈청량을 1/2 ~ 1/10 정도로 낮춤.

7 세포 및 조직 배양용 시약류 염류용액 (Balanced salt solution, BSS) pH 지시약
Hanks solution Earle solution Phosphate buffered saline (PBS) pH 지시약 0.2% Phenol red 조직으로부터 세포 분리용 효소 Trypsin Dispase (세균유래 중성 protease)

8 혈청 (Serum) Hormone 또는 성장인자의 공급원 물에 불용성 또는 난용성 물질의 용해성 개선 (지방산)
표면에 대한 접착성 개선 FBS (Fetal bovine serum) CS (Calf serum) HS (Horse serum) 혈청배양 10% 전후의 혈청 첨가 세포의 증식 • 분화의 완전제어 불가능 세포가 분비하는 미량물질 정제를 방해 대량 배양시의 경제성 문제 무혈청배양

9 세포의 계수 Cell counter Haematocytometer (혈구계산판)

10 배양세포의 보존 계대(transfer)의 반복으로 인한 형질전환, 오염 가능성 동결보존법
완서동결 (-1°C/분) 액체질소온도보존 (-196 °C) 보호제 : Glycerin, DMSO (15%) 해동 : 30 ~ 37℃안에서 해동시킴