바이러스 배양 면역혈청파트 박정용.

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1 바이러스 배양 면역혈청파트 박정용

2 목 차 바이러스 검출방법 세포배양 바이러스배양 바이러스 별 특징 우리나라 및 병원의 검사현황 세포배양방법 적정배지 성분, 조건
목 차 바이러스 검출방법 세포배양 바이러스배양 세포배양방법 적정배지 성분, 조건 바이러스별 적정 세포 및 CPE관찰 바이러스 별 특징 우리나라 및 병원의 검사현황

3 바이러스의 검출방법 면역 혈청법 Hybridization RT PCR/PCR Real time PCR 배양법
Genotyping불가 조기 진단 불가 Hybridization Low sensitivity Low confidence RT PCR/PCR False signal 한계적 multiplex 바이러스의 검출방법 Real time PCR False signal 한계적 배양법 Time-consuming Genotyping 불가 조기 진단 불가 1.배양법은 시간이 많이 걸리고 genotype이나 조기진단이 불가한 면이 있지만 그래도 바이러스 진단에 있어서 gold standard로 여겨지고 있습니다. 기본적인 배양법 외에 shell vial culture등과 같은 조기에 진단이 가능한 방법도 있습니다. 2. 혈청학적 진단법으로는 immunoblotting이나 fluorescence assay등이 있습니다. Myxoviridae 에 속하는 바이러스들은 표면에 haemagglutinin이 있어서 hemagglutination방법을 이용하고 HI 등의 방법으로 serotype을 결정 하기도 합니다. 이 외에도 EIA나 CF 같은 방법도 있습니다 3. PCR은 많은 LAB에서 확진으로 쓰고 있는데 배양을 해서 진단이 나거나 의심스러운 경우 PCR을 하기도 합니다. Multiplex pcr을 하면 2~5개 까지의 바이러스가 동정될 수 있습니다. 그러나 이 또한 쉽지 않고 일반적인 pcr의 단점인 False signal문제를 넘어갈 수는 없습니다. 물론 multiplex PCR도 그렇게 쉽지는 않다고 합니다. 4. REAL TIME PCR도 진단에 이용될 수 있습니다. 5. 이 외에도 여러가지 hybridization방법을 응용하여 진단하기도 합니다.

4 세포배양 바이러스 분리 Obligate intracellular parasites Cell culture
기존의 fertile hen’s egg나 실험동물에서 배양하였던 것을 세포를 이용하여 실험실에서 분리할 수 있음 Cell culture Flat bottomed glass, plastic container( tissue culture용 petri dish, flask, bottle, tube)등을 이용하여 단층으로 세포를 배양 절대 세포내 기생성 생물 복제 위해 반드시 살아있는 세포를 필요로 하는 생물이며

5 2. 세포 배양 3. 세포의 종류 Primary cells Semi-continuous cells
동물이나 인간의 조직에서 직접 분리,배양되는 세포로 1~2회 정도의 subculture만이 가능한 세포(e.g. primary monkey or baboon kidney) Semi-continuous cells 인간의 fetal tissue에서 분리가 된 것으로 20~50 회의 subculture가 가능한 세포( e.g. human lung fibroblasts such as MRC-5) Continuous cells 종양조직에서 분리되어 영구히 배양되는 세포( e.g. Vero, Hep2 ) 3. 세포의 종류 Adherent cell fibroblast, 뇌, 근육세포 등은 배양용기의 바닥에 붙어 성장( 세포가 잘 자랄 수 있도록 용기에 코팅 처리됨) Non-adherent(suspension) cell lymphoid, myeloid cell (blood cell)-배지에 부유된 상태로 성장 절대 세포내 기생성 생물 염류: KCl, NaCl, Na3PO4, CaCl2, MgSO4, 등 양분:  glucose, vitamins, amino acids, sodium pyruvate 등 완충용액 및 항생물질(항진균 물질) fetal bovine serum: 성장인자 (growth factors)

6 4. 세포 배양방법 Inorganic salts
retain the osmotic balance of the cells, regulate membrane potential by provision of NA, K and Ca ions Carbohydrates; glucose, galactose, maltose, fructose Amino Acids Vitamins 세포의 성장, 분화에 필요 Fatty acids and lipids ; cholesterol, steroid Proteins and peptides ; albumin, fibronectin buffering system ; 대부분 세포의 적정 pH 7.2~7.4 Sodium bicarbonate (NaHCO3) 또는 HEPES로 조절 phenol red 배지 내 pH지시약 ; yellow ; acid, purple ; alkali 절대 세포내 기생성 생물 염류: KCl, NaCl, Na3PO4, CaCl2, MgSO4, 등 양분:  glucose, vitamins, amino acids, sodium pyruvate 등 완충용액 및 항생물질(항진균 물질) fetal bovine serum: 성장인자 (growth factors)

7 5. Media Basal media Complex media Serum free media Serum
MEM (Minimal Essential Medium)-adherent cell DMED (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) GMEM Complex media RPMI-주로 suspension cell 배양에 사용 Serum free media Serum albumin, growth factor- fetal bovine serum(FBS): newborn calf serum, horse serum -heat inactivation 과정 필요 ; 56 ℃, 30분 처리 앞의 영양성분은 상품화되어 판매됩니다. 그래서 이 배지를 녹여서 buffer를 맞춘 후 FBS를 넣어 영양성분을 추가하고 다시 항생제를 넣어서 최종 배양액을 만들게 됩니다. 이렇게 하면 세포가 성장에 필요한 조건을 맞출 수 있습니다.

8 바이러스 배양 virus Cell line(strain) HSV
Vero, HEp2, Human diploid(HEK, HEL), human amnion VZV Human diploid(HEL, HEK) CMV Human diploid fibroblasts Adenovirus HEp2, HEK Echo MK, BGM, LLC-MK2, Human diploid, Rd Influenza A MK,LLC-MK2,MDCK Influenza B Parainfluenza MK, LLC-MK2 Mumps MK, LLC-MK2, HEK, Vero RSV HEp2, Vero Rhinovirus Human diploid(HEK, HEL) Measles MK, HEK Rubella Vero, RK13 바이러스는 자기들이 잘 성장할 수 있는 세포가 다 다릅니다. 가령 예를 들어 HSV같은 것들은---- CMV는 ---것들을 쓰고 AND은 ---- 인플루엔자는 MDCK 등에서 잘 자라고 RSV는 ---에서 자라면 기타 세포들에서 특징적으로 자랄 수 있습니다.

9 (Madin Darby Canine Kidney)
MDCK (Madin Darby Canine Kidney) Virus susceptibility Vesicular stomatitis Indiana virus Vaccinia virus Coxsackievirus B5 Reovirus type 2 Adeno-associated virus 4 Adeno-associated virus 5 vesicular stomatitis (Indiana); vaccinia; coxsackievirus B5; reovirus 2, 3; adenovirus 4, 5; vesicular exanthema of swine; infectious canine hepatitis Virus resistance Coxsackievirus B3 Coxsackievirus B4 Poliovirus 2 IFNV-CPE 본 슬라이드부터는 이제부터 쓸 세포들의 특징을 간단히 보시겠습니다. MDCK라는 세포는

10 MRC-5 poliovirus 1 Virus susceptibility herpes simplex
vesicular stomatitis (Indiana) CMV-CPE

11 HEp-2 Virus susceptibility Poliovirus 1 Adenovirus type 3 Vesicular stomatitis Indiana virus HSV-CPE HEP2에서는 이런 장방형의 세포가 자라게 되는데 실제 cpe를 잘 관찰하려면 세포를 키우되 바닥에 경계가 없을 정도로 빼곡히 키운다음에 접종을 해야 CPE를 제대로 관찰할 수 있습니다. 그것은 어떤 세포나 다 마찬가지입니다. 4배로 키운 그림에서는 잘 보이지 않는데..실제 20배로 키우면 다핵거대세포가 중간중간에 생기게 됩니다.

12 MRC-5 CMV 접종 X4 X4 X4 X20 X20 X20 접종 전 5 일 경과 7 일 경과 (음성대조)

13 MRC-5 HSV 접종 X4 X4 X4 X20 X20 X20 접종 전 3 일 경과 5 일 경과 (음성대조)

14 MRC-5 RSV 접종 X4 X4 X4 X20 X20 X20 접종 전 3 일 경과 5 일 경과 (음성대조)

15 MRC-5 ADN 접종 X4 X4 X4 HEp2 X20 X20 접종 전 일 경과 (음성대조)

16 바이러스 별 특징 절대 세포내 기생성 생물 복제 위해 반드시 살아있는 세포를 필요로 하는 생물이며

17 http://www. virustaxonomyonline. com/virtax/lpext. dll

18 Respiratory Syncytial virus(RSV) MetaPneumoVirus(MPV)
Parainfluenza 2,4 (PIV2,4) Parainfluenza 1,3 (PIV1,3) measles Paramyxoviridae Paramyxovirinae Respiratory Syncytial virus(RSV) MetaPneumoVirus(MPV) Pneumovirinae Influenza A Influenza B Influenza C Orthomyxoviridae 먼저 우리가 배양하고자하는 바이러스입니다. 첫째는 임상요구도가 있는 호흡기 바이러스입니다. 그중에서 paramyxoviridae와 Orthomyxoviridae, Adenoviridae 에 속한 바이러스들을 보려고 합니다. paramyxoviridae에는 우리가 잘 아는 RSV와 PIV가 있습니다. Orthomyxoviridae에는 인플루엔자가 있습니다. , Adenoviridae 에는 아데노바이러스가 있습니다. 둘째는 현재 우리 병원에서 혈청학적으로 검사하는 바이러스 중 그래도 빈도가 많은 바이러스인 CMV와 HSV를 선택하였습니다. 둘 다 Herpesviridae 속합니다. Adenoviridae Adeno virus(ADV) Cytomegalo virus(CMV) Herpes Simplex virus(HSV) Herpesviridae

19 인플루엔자 (IFNV) 개요 single-stranded RNA가 있고 지단백 envelope에 싸인 긴 구형의 바이러스, Host: 인간, 새,돼지,말 등,야생조류가 natural host 표면항원 2개- NA(neuraminidase), HA(hemagglutinin) HA(H1~H16): 세포에 부착 NA(N1~N9) : 세포 내로 침투 특성 항원대변이-A형에서 일어나며 HA,NA의 변화가 기존 것과 전혀 다른 변화를 보이는 것, 중복감염 후 유전자 재조합이 체내에서 일어나 형성됨, 인플루엔자 pandemic과 연관됨 항원소변이-A,B형에서 일어나며 아형에서 약간의 항원변화가 생기는 것, RNA의 점돌연변이로 몇 개의 아미노산의 변화에 의한 항원의 변화, 인플루엔자 epidemic의 원인 H1,2,3 x N1,2

20 인플루엔자로 인한 사망률의 전체사망당 비율 변이 곡선
Type A Type B Type C Severity of illness ++++ ++ + Animal reservoir Yes No Human pandemics Human epidemics yes No(sporadic) Antigenic changes Shift, drift drift Segmented genome Surface glycoproteins 2 (1) 인플루엔자로 인한 사망률의 전체사망당 비율 변이 곡선 (미국,’99~03) INFV-B는 PANDEMIC하지 않다는 특징이 있다. Influenza type A- NA,HA 두 항원의 혼합으로 subtype결정 Influenza type B- A형보다 경한 증상을 보임, 주로 소아에게서 발생 subtype 없음,no pandemics,Reye증후군발생과 관련 Influenza type C- 사람 감염은 거의 없음, no pandemics, epidemics Percentage of all death caused by influenza and pneumonia-세로축 출처: CDC MMWR 2003

21 인플루엔자 진단 3. 실험실 진단 Procedure types Acceptable specimens
Time of results Rapid result Viral culture A & B NP, throat swab,nasal wash,bronchial wash, nasal asp.,sputum 5-10day no DFA NP swab, swab,nasal wash,bronchial wash, nasal asp.,sputum 2-4 hrs RT-PCR 1-2hrs Serology Paired acute & convalescent serum samples >2 weeks EIA NP,throat swab, nasal wash, bronchial wash 2 hrs

22 인플루엔자 진단-Rapid tests Procedure types Acceptable specimens Times of
results Rapid result Directigen Flu A (BD)® A NP, throat swab,nasal wash,asp. <30 min Yes Directigen Flu A*B (BD) ® A & B FLU OIA (Thermo Electron) ® NP, throat swab,nasal asp. Sputum FLU OIA A/B XPECT Flu A&B (Remel) ® NP, nasal wash throat swab NOW Influenza A&B (Binax) ® NP swab, nasal wash QuickVue Influenza test (Quidel) ® NP swab, nasal wash, asp. SAS Influenza A,B test A or B NP wash, NP asp. ZstatFlu (ZymeTx) ® Throat swab 출처:

23 국내 인플루엔자 발생 인플루엔자 분리현황(97~04) 주 별 인플루엔자 의사환자 발생분율 2000~2004
미국내 인플루엔자 발생현황 (04~05) 발생분율=의사환자수/(총외래환자수*1000) 다. 2002~2003절기 인플루엔자 의사환자 발생 주별 인플루엔자 의사환자 발생분율이 2002년 46주(11월 3째주)～50주(12월 2째주)에 대규모의 유행을 보였다. 이는 유행규모면에서도 예년에 비해 매우 컸을 뿐만 아니라, 시기면에서도 지난 2000~2001절기, 2001~2002절기보다 유행이 빨리 시작되어서 비교적 짧은 시기에 폭발적으로 증가하였다가 급격히 감소하는 양상을 보였다 출처: 질병관리본부, CDC( MMWR)

24 RSV (Respiratory Syncytial Virus)
개요 RSV는 paramyxoviridae, Pneumovirus에 속하고 다양한 형태로 (enveloped, pleomorphic)직경이 nm, single-stranded RNA 를 갖음 2개의 subtype (A, B) 특성 가장 중요한 하기도 감염 질환의 원인(영아, 유아) Rhinitis(성인), bronchiolitis(영,소아), pneumonia(영,소아), otitis media(미취학아동) 모든 bronchiolitis 의 75%는 RSV가 원인

25 호흡기 질환에서의 RSV, Influenza분리
Bronchiolitis유병율과 RSV 분리곡선

26 Adenovirus 개요 Adenoviridae에 속하는 DNA바이러스 구형이며 49개의
Hexon Double-stranded DNA Penton fiber Adenovirus 개요 Adenoviridae에 속하는 DNA바이러스 구형이며 49개의 혈청형이 알려짐, 호흡기는 B,C,E의 아형이 주로 감염 240 hexon과 12 penton으로 구성된 단백질로 둘러 싸임 호흡기 외에 결막염, 방광염, 뇌막염, 위장관 감염 Parainfluenza, RSV등과의 감별이 어려움 계절적 변이 있으나 산발적임

27 INFV 전처리된 검체- 수송배지 2mL (saline 100mL+P/S 100 µl) : BAL, sputum, tracheal fluid, blood, vesicle fluid, Swab etc. ADD sample 600 µl to 200 µl 의 P/S+N(각각 100 µl) Well mix 4℃ incubation 1 hr. Centrifuge 2000(or 3000)rpm, 20 min 상층액을 aliquot해서 보관하고 상층액 200 µl를 접종( to 500µl 접종용 배지) 배양배지(Growth media) MEM 495 mL+ 5mL P/S =B sol B sol 45mL에 5mL FBS=10% FMB 분주 직전에 만들어 성장배지만들어 MDCK배지를 만든다. 접종배지(Inoculation media) Vitamin sol mL D-Glucose µl Trypsin(TPCK treated) µl P/S µl Add MEM to 50 mL 로 접종하고 7~10일간 관찰한다. 증류수 10mL에 20mg의 가루 Trypsin(T8003, sigma)을 타서 1mL씩 aliquot해 둠(배지 내 working conc.:2 µ/ mL)

28 CMV,HSV 검체 처리 Antibiotic-antimycotic sol 배양배지(Growth media)
Urine, bronchial washing BAL, aspirate etc. 검체 처리 sputum stool swab은 PBS에 Filter(0.45um) CSF Tissue는 소량의 PBS와 섞어서 Grinding 후 Antibiotic-antimycotic sol Penicillin+streptomycin+amphotericin 배양배지(Growth media) MEM 495 mL+ 5mL AB/AM =A sol A sol 45mL에 5mL FBS=10% FMA 분주 직전에 만들어 성장배지만들어 MRC-5(or HEp2)배지를 만든다. 접종배지(Inoculation media) A sol 49mL에 1mL FBS=2% FMA 분주 직전에 만들어 유지 배지 만든다 접종 후 다음날 한번 배지(2%FMA)를 갈아주고 3~4일 후 관찰 HSV, VZV, Entero: 7일 관찰 CMV, INFA, RSV,Adeno: 28일 관찰

29 HA(hemagglutination)-INFV
배양액 상층액으로 2 fold dilution 분주 O cell susp(5%) 를 분주 2~4시간 정치 후 판독 1:64 양성이면 양성 IFA(DFA)- CMV,HSV,Respiratory virus(RSV,ADV,IFNV) 배양액 Cell부분을 slide위에 도말 fix 후 1st antibody 반응시키고 2nd antibody반응시킨 후 형광 현미경 관찰

30 호흡기 바이러스 감염 입원환자의 호흡기바이러스 유병율 핀란드, 2001~2002
RHINO, rhinovirus; RHI-ENT, rhino/enterovirus; ENTERO, enteroviruses; HMPV, human metapneumovirus; PARA 1–3, parainfluenza virus types 1–3; INFLU A/B, influenza A and B viruses; ADENO, adenovirus; CORONA, coronavirus; MIXED, mixed viral infection. 입원환자의 호흡기바이러스 유병율 핀란드, 2001~2002 출처: CDC, EID June 2004

31 우리나라 바이러스검사실 현황 바이러스 배양검사 병원(기관) 서울대학교 병원-호흡기 , 소화기 및 기타
RSV, PIV, ADV, Entero V., CMV, HSV, 한강성심병원-호흡기, 소화기 RSV, PIV, measles, IFNV, Entero V.(Coxsakie),HSV,CMV,VZV,BKV 삼성서울병원 IFNV, Entero V.(Coxsakie),HSV,CMV 서울 아산병원 RSV,PIV, IFNV, Entero V., CMV, HSV, 질병관리본부 RSV, PIV, ADV, measles,mumps, IFNV, Entero V., CMV, HSV, 신촌 세브란스 병원

32 Hepatitis virus (HAV,HBV,HCV)
바이러스관련 혈청검사 바이러스 대상 환자(과) 현재 검사 CMV HSV VZV 전체 EIA(BEPIII) Hepatitis virus (HAV,HBV,HCV) EIA, MEIA HIV RSV 호흡기, 알레르기 IC Rubella 산부인과, 이식, 종양 ELFA HPV 산부인과 Hybrid capture Rota virus 소아과 Latex agglutination