-Hematoxylin & Eosin Stain과 Special Stain-

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1 -Hematoxylin & Eosin Stain과 Special Stain-
Miz Medi HOSPITAL 조직 Stain의 개요 -Hematoxylin & Eosin Stain과 Special Stain- 병리과 조직 파트 황정현

2 Hematoxylin & Eosin Stain
Miz Medi HOSPITAL Hematoxylin & Eosin Stain 일반적인(Routine) 염색법 병리조직표본의 가장 기본적인 염색법 표본 전체를 개괄적으로 보기 위한 염색법 Eosin Hematoxylin          세포의 핵, 특히 핵 내의 염색질과 핵막에 염색 핵의 핵질(nucleoplasm)은 염색 되지 않은 채로 남기 때문에 염색질 의 염색패턴을 쉽게 볼 수 있음.          H&E염색에서 Eosin은 대조염색으로 사용 Hematoxylin에 염색되지 않는 거의 모든 구조에 붉은 색으로 염색

3 H&E Stain 원리 되고 여기에 매염제인 alum이 결합하여 가염상태인 alum-hematein lake를 형성한다.
Miz Medi HOSPITAL H&E Stain 원리 Hematoxylin이 산화제(mercuric oxide)에 의해 hematein이 생성 되고 여기에 매염제인 alum이 결합하여 가염상태인 alum-hematein lake를 형성한다. 이 lake는 등전점(pH 2.9)에서 양(+)이온을 띠며 음(-)이온으로 하전되는 DNA의 인산기와 결합하여 청색을 띤다. 반대로 산성염료인 eosin은 등전점 pH 5.8에서 음(-)이온을 세포질내의 백질은 양(+)이온으로 하전되어 이온결합을 하여 분홍색으로 염색된다

4 Hematoxylin Miz Medi HOSPITAL Hematein Hematoxylin
  피나무의 심재에서부터 추출하는 염료는 hematoxylin, hematein 등의 혼합물. hematein은 hematoxylin의 산화로 만들어짐. hematein은 색깔을 내기는 하나 잘 달라 붙지 않음. hematoxylin 염기성 염료로 분류  껍질(bark) 흰 액재(sap-wood) 심재(core) 조직에서 인산기가 많이 들어 있는 곳은 세포 핵. (DNA와 RNA는 당과 인산으로 되어 있기 때문) 조직에서 산성을 띠는 황산기가 많이 들어 있는 곳은 연골 기질(chondroitin sulfate라는glycosaminoglycan) 세포핵이야 어느 세포에도 있으나 연골 기질은 연골 세포 주위에만 있으므로 hematoxylin 염색이라 함은 핵 염색 을 뜻함. hematoxylin 염색의 주된 목적은 핵 염색!!

5 Hematoxylin Principle Miz Medi HOSPITAL Hematoxylin의 산화
Lab of Developmental Biology Miz Medi HOSPITAL Hematoxylin Hematoxylin의 산화 (산화제 : 공기, sodium iodate, mercuric oxide) Hematein + 매염제(Aluminum) Hematein lake (복합체) pH 2.9에서 (+) Charge (-) Charge의 핵내 인산기와 결합 Bluing (청색화) (Ammonia water, tap water) Hematoxylin solution 활성성분은 hematein이며, 이것은 Aluminum, Iron 등과 같은 금속이온과 복합체로 존재. Hematein+Aluminum 복합체를 Hematein lake라하며, 이는 pH 에서 (+)charge 핵내에 존재하는 인산기는(-)charge를 띄고 있으므로 hematein lake와 결합. 금속이온으로 aluminum이 사용되었을 경우에는Hematoxylin이 청색으로 염 색되고, Iron이 사용되었을 경우에는 Black 또는 Blueblack으로 염색. Hematoxylin solution은 그 처방에 따라 색상(hue), 강도(intensity), staining pattern이 다양. Principle

6 Eosin Miz Medi HOSPITAL Eosin은 fluorescein의 유도체. 새벽 하늘의 장밋빛
염기성을 띠는 원자단으로서 세포의 안팎에 널리 분포하고 있는 것은 단백질의 아미노기 (NH3+). 그래서 eosin을 이용하여 염색.   조직 염색에서는 hematoxylin으로 세포핵을 염색한 후 세포질이나 세포 바깥 구조를 대 비시키기 위해 eosin으로 대조 염색. 핵에도 여러 가지 단백질이 들어 있어 eosin 에 붉으스레 염색되나 hematoxylin에 의한 진한 푸른색 때문에 감춰짐. eosin으로 염색한 결과는 새벽 하늘의 붉은 빛. 새벽 하늘의 붉은 빛이 매력적이어서인지 eosin을 립스틱이나 매니큐어에 넣기도 함.

7 H&E Stain 순서 Miz Medi HOSPITAL 3. 핵 염색(Hematoxylin)
1. 파라핀제거(deparaffin) 현미경 관찰을 위해서는 염색을 하는데 염색약은 대부분 수용성 파라핀 절편은 소수성이므로 파라핀을 제거해야 함. 자일렌이나 톨루엔을 이용 Slide를 자일렌에 넣고 3분, 이과정을 4번 연속 시행 자일렌을 제거하여 염색 직전까지 가는 단계 자일렌을 제거하기 위해서는 다시 알코올이 이용되고 알코올을 제거하기 위해서는 물을 이용 100% 알코올에 3분씩 2번 거치고, 95% 알코올 3분 한번 2. Xyxlene 제거 및 함수 3. 핵 염색(Hematoxylin) 조직 속의 여러 가지 물질들의 성질에 따라 서로 다른 색이 입혀질 수 있도록 염색을 함 Hematoxylin 용액에서 8분 후 흐르는 물로 2분 수세

8 H&E Stain 순서 Miz Medi HOSPITAL 6. 세포질염색(Eosin) 4. 감별탈색
(differentiator) 제작한 0.3% Hcl-Alcohol로 1~2회 빠르게 Deep 바로 흐르는 물로 수세한다 주의 : 오래 있으면 색이 다 빠져 감별할 수 없다 제작한 0.3% Ammonia Water로 2~3회 Deep 후 흐르는 물로 수세 Ammonia Water 대신 Scott tap water sk 1% lithium carbonate 용액을 사용하기도 한다 5. 중화 현색 (Blueing) 6. 세포질염색(Eosin) H&E염색에서 Eosin은 대조염색으로 사용 Hematoxylin에 염색되지 않는 거의 모든 구조에 염색

9 H&E Stain 순서 Miz Medi HOSPITAL 9. 봉입(Mounting) 물을 제거하기 위해서는 알코올을 이용
70%, 95%, 95%, 100% 알코올을 이용. (저->고농도 알코올의 순서) 각 2분정도씩 주어 충분하게 물이 빠질 수 있도록 한다 7. 탈수 (Dehydration) 탈수를 하기 위해 사용했던 알코올을 제거하여 봉입 직전까지 가 는 단계 자일렌에 3분씩 4번 거친다. 봉입액과 물은 섞이면 뿌옇게 보이므로 주의한다. 8. 투명 (Clearing) 9. 봉입(Mounting) 염색을 마친 조직 Slide는 자일렌 속에 담구어진 상태 이것을 영구히 보존하기 위해서는 건조와 부패가 되지 않도록 mounting sol.을 이용 최종적으로 커버글라스를 덮는다

10 H&E Stain의 염색 결과 Miz Medi HOSPITAL
Nuclei red Cytoplasm yellow Intercellular fiber pink

11 H&E, Breast , 100X

12 H&E , D/E , 100X

13 H&E Breast needle Bx, 40X

14 H&E, Cervix punch Bx, 40X

15 H&E, Cone Bx, 100X

16 H&E, Placenta, 40x

17 H&E, Stomach, 100X

18 H&E, Esophagus, 40X

19 H&E, Rectum, 40X

20 목차 Special Stain McManus의periodic acid-Schiff (PAS)염색법
Miz Medi HOSPITAL Special Stain 목차 Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli (AFB) 염색법 McManus의periodic acid-Schiff (PAS)염색법 Diastase PAS의 glycogen 증명법 Masson trichrome 염색법 Mayer Mucicarmine 염색법 Reticulum fiber stain (Gomori’s method)

21 Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색
Miz Medi HOSPITAL Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색 목적 조직 내의 항산성균 및 항산성 물질의 증명에 이용 항산성균의 대표적인 것 - 결핵균(Tubercule bacilli) - 나균(Lepra bacilli) - Nocardia AFB 사진 AFB (+), 400x

22 Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색
Miz Medi HOSPITAL Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색 원리 항산성 염색이란? 무기산(염산, 황산)에 의한 탈색에 저항하는 성질을 이용한 염색법 항산성 간균(Acid fast bacilli)은 표면이 밀납양 물질로 덮여있음 fuchsin 등의 염기성렴료수용액에는 염색이 되지 않는다 페놀을 매염제로 사용하면 강하게 염색되고, 이 염색된 것은 무기산 용액이나 알코올에 쉽게 탈색되지 않는다

23 Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색
Miz Medi HOSPITAL Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색 단계 작용기전 시약, 염료 반응시간 1 염색 Ziehl-Neelsen's carbol fuchsin solution (kit 2) 30 분 2 수세 흐르는 물 2 분 3 배경탈색, AFB감별 1% Hcl alcohol (kit 3) 15 초 4 5 대조염색 1% Methylene blue solution (kit 4) 5분 6 ★ 현재는 Tb-color cold staining kit를 사용하고 있음

24 Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색
Miz Medi HOSPITAL Ziehl-Neelsen's Acid fast bacilli(AFB)염색 Acid-fast bacilli bright red (carbol fuchsin) Nocardia filaments, Lepra bacilli red Nuclei blue Background pale blue (methylene blue)

25 Periodic acid-Schiff reaction (PAS)
Miz Medi HOSPITAL Periodic acid-Schiff reaction (PAS) 목적 및 원리 다당류와 글리코겐, 점액물질의 증명법 색소과립이나 세포과립, 진균, 아메바의 감별 및 사구체 병변의 감별 등 당질의 일반적인 염색으로 널리 사용 당원, 점액, 각종 미생물, 기저막 등을 선명하게 볼 수 있다 1,2 glycol기를 갖는 당질을 periodic acid로 산화하여 디알데하이드를 유리 이 알데하이드는 Schiff 시약과 결합하면 qunoid계 발색단(붉은색)을 형성한다

26 0.5 % Periodic acid solution
Miz Medi HOSPITAL Periodic acid-Schiff reaction (PAS) 단계 작용기전 시약, 염료 반응시간 1 산화에 의한 알데하이드 산출 0.5 % Periodic acid solution 15 분 1a - -> 수세하지 않는다 2 qunoid계 발색단 형성 Schiff reagent 30 분 3 발색 흐르는 물 10 분 4 핵염색 Hematoxylin 8 분 5 수세 5분 6 탈색 1% Hcl-Alcohol 2~3회 dips 7 2~3회 8 핵의 청색화 1% Ammonia water 5~10회 dips 9

27 Periodic acid-Schiff reaction (PAS)
Miz Medi HOSPITAL Periodic acid-Schiff reaction (PAS) Nuclei blue(Hematoxylin) 세포질 및 background pale pink PAS 양성물질 (Mucin, Glomerular capsule, Basement membrane, Fungi, Amyloid, Reticulum, Glycogen) red-reddish purple

28 Diastase Periodic acid-Schiff reaction (D-PAS, Glycogen)
Miz Medi HOSPITAL Diastase Periodic acid-Schiff reaction (D-PAS, Glycogen) 목적 및 원리 조직내의 true glycogen을 증명 당원이 Diastase에 소화됨을 근거로 하여 PAS양성 물질의 소실여부를 판단 당원과 관련된 피부, 근육 및 간질환, 염증성질환, 전이암의 원발장기 색출 유용 Diastase를 처리하여 PAS염색을 하고 Diastase를 처리 없이 PAS염색을 하여 두 슬라이드를 비교하여 당원의 존재를 여부를 증명 ★ Diastase 대신 사람의 타액에는 ptyalin이란 amylase가 함유되어 있어 당원 소화에 이용 한다

29 0.5 % Periodic acid solution
Miz Medi HOSPITAL Diastase Periodic acid-Schiff reaction 단계 작용기전 시약, 염료 반응시간 1 당원의 소화 소화(Digestion)용액 1시간 2 수세 흐르는 물 5분 3 산화에 의한 알데하이드 산출 0.5 % Periodic acid solution 15 분 3a - -> 수세하지 않는다 4 qunoid계 발색단 형성 Schiff reagent 30 분 5 발색 10 분 6 핵염색 Hematoxylin 8 분 7 8 탈색 1% Hcl-Alcohol 2~3회 dips 9 2~3회 핵의 청색화 1% Ammonia water 5~10회 dips P A S 와 동일

30 Periodic acid-Schiff reaction (PAS)
Miz Medi HOSPITAL Periodic acid-Schiff reaction (PAS) Glycogen red Nuclei blue Cytoplasm pale pink Diastase-소화처리 Diastase-소화처리 X Glycogen PAS음성(pale pink) PAS양성(red, magenta) Glycogen 외 기타 PAS 양성조직

31 Masson’s Trichrome stain (Collagen)
Miz Medi HOSPITAL Masson’s Trichrome stain (Collagen) 목적 및 원리 조직 구조내의 세공과 염료 분자의 크기의 차이와 염료 투과성의 차이가 있음에 착안한 경험적 방법 교원섬유를 보기 위한 염색법으로 세포간 섬유와 구별이 좀 더 용이하다 picric acid에 의해 조성된 산성용액에서 교원섬유는 aniline계 염료인 acid fuchsin과 선택적 결합을 한다 신사구체의 혈관 중막세포 (mesangial cell)이 염색되어 그 증식여부를 알 수 있기 때문에 임상적으로 많이 선호 하는 염색법이다

32 Masson’s Trichrome stain (Collagen)
Miz Medi HOSPITAL Masson’s Trichrome stain (Collagen) 단계 작용기전 시약, 염료 반응시간 1 조색 Bouin solution 56℃ 1시간 2 핵염색 Weigert hematoxylin solution 10분 3 수세 흐르는 물 4 배경염색 Biebrich scarlet-acid fuchsin solution 5분 5 매염과 탈색 Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution 6 교원섬유 염색 Aniline blue solution 7 비결합 Aniline blue의 탈색 Glacial acetic acid solution 8

33 Nuclei -------------- Black (Weigert iron hematoxylin stock solution)
Miz Medi HOSPITAL Nuclei Black (Weigert iron hematoxylin stock solution) Cytoplasm, Keratin, Muscle, fibers, Intercellular fibers red (Biebrich scarlet-acid fuchsin) Collagen blue (aniline blue) Masson’s Trichrome stain, 40X

34 Reticulum fiber stain (Gomori’s method)
Miz Medi HOSPITAL Reticulum fiber stain (Gomori’s method) 목적 및 원리 Pot. permanganate(팽화 작용)와 iron alum으로 호은성을 강화시키고 선택성을 높이는 조작을 한 후 ammonical silver 용액내의 은 ammonia 착염이 망상섬유와 이온화학적 반응으로 결합함 이것을 가시화하기 위해 환원제를 이용하여 금속은(metalic silver)으로 변화, 조색제(metalic gold)를 처리하여 선명도를 높인 후 은을 정착시킨다 초기 간경변, 혈관에 생긴 종양의 감별진단 및 상피종과 육종의 감별진단 등에 쓰인다

35 Miz Medi HOSPITAL 망상섬유 팽화 0.5% pot. permanganate solution 탈색
단계 작용기전 시약, 염료 반응시간 1 망상섬유 팽화 0.5% pot. permanganate solution 2분  2 수세 흐르는 물 3 탈색 2% pot. metabisulfite solution 1분 3a 2분 4 감작(은침투력 증가) 2% Ferric ammonium sulfate solution 3분 이상 4a 세척 증류수 5 망상섬유내 은침투 Ammonical silver solution 5a 세척(침투정지) 10회 이상 잠적 6 은환원에 의한 발색 20% Formalin solution 5분, 갈색 6a 1분  7 조색 0.2% Gold chloride solution 10분 7a 8 감별 3분 8a 9 은정착, 비 결합은 제거 2% Sodium thiosulfate solution 5분 10

36 Reticulum fiber stain (Gomori’s method)
Miz Medi HOSPITAL Reticulum fiber stain (Gomori’s method) Reticular fibers 흑갈색, black (ammonical sliver) Background gray (회색) Collagen fibers 적갈색, 황갈색 Nuclei black

37 Mayer’s Mucicarmine stain (Mucin)
Miz Medi HOSPITAL Mayer’s Mucicarmine stain (Mucin) 목적 및 원리 Carmine염료와 aluminum(매염제)의 결합물인 dye-mordant가 mucin과 반응하면 진한장미색으로 발색되는 염색방법 상피세포로부터 분비되는 점액의 증명에 좋으며, 결체조직에 존재하는 점액은 염색력이 약하다 점액을 염색함으로서 선상피와 편평상피에서 유래되는 종양 등을 구별할 수 있고 특히 Cryptococcus의 협막이 염색되어 진균감염을 진단

38 Mayer’s Mucicarmine stain (Mucin)
Miz Medi HOSPITAL Mayer’s Mucicarmine stain (Mucin) 단계 작용기전 시약, 염료 반응시간 1 핵염색 Weiger’s hematoxylin solution 10분 2 수세 흐르는 물 3 점액의 선별 염색 Mucicarmin working solution 56℃ 1시간 증류수 1분 4 배경염색 Metanil yellow 15초~1분 4a ★ Control Slide를 준비한다

39 Miz Medi HOSPITAL Mucin deep rose to red Capsule of Cryptococcus deep rose to red Nuclei black Other tissue elements yellow