Technical Tips & Cautions

Technical Tips & Cautions
1. DNA Extraction에서 주의 사항 2. Hybridization & Detection에서 주의 사항 3. False Band가 보고된 case 4. Woongbee Ambiguity Data 5. Woongbee New Data

High Quality DNA & Optimal concentration
DNA Extraction 주의 사항 왜 DNA Extraction이 중요한가 HLA 실험 성공을 결정짓는 Key Step 쉽지만, 가장 중요한 실험 High Quality DNA & Optimal concentration = Best Results

DNA Extraction 주의 사항 채혈 및 Blood 보관
1. Anticoagulant - ACD 또는 EDTA recommend ; Heparin은 PCR의 inhibition을 초래함 2. 채혈 후 5일 이내는 4C 보관 가능 3. HLA interpretation이 끝날 때까지 blood를 4C 보관 - 냉동보관은 절대 하지 말것 4. Interpretation이 완료되면, DNA를 분리하여 4C or -20C 보관 * 냉동 보관한 Blood를 녹일 때는, 37C에서 빠르게 녹인 후, Extraction 전까지 냉장 또는 On ice 보관

DNA Extraction 주의 사항 DNA Extraction 사전 확인 사항 Cell 수 확인 (특히 혈액종양내과)
정상 범위 (4,000 ~ 10,000/ul)일 경우는 Normal protocol을 이용하여 분리 정상보다 적거나, 많을 경우는 웅비 권장 protocol을 이용하여 분리

DNA Extraction 주의 사항 DNA Quality & Optimal Concentration
1. Dynal Recommend (Package insert P. 9. Note 참조) ; A260/A ~ 1.80 13 ~ 15 ng/ul i.e. 약 200 ng을 PCR에 사용할 것을 권장 A B Cw DRB

DNA Extraction 주의 사항 DNA Quality & Optimal Concentration
; PCR inhibition으로 인한 False band의 원인 3. 13 ng/ ul 이하의 DNA를 사용했을 경우의 문제점 ; PCR 증폭이 되지 않는 원인이 될 수 있음 4. 너무 많은 DNA를 사용했을 경우의 문제점 (아래 그림 참조) ; 몇몇 allele들만 증폭되거나, 증폭되지 않는 문제점 ; 즉, False Positive or False Negative의 원인이 됨

DNA Extraction 주의 사항 DNA 정량 (Dynal DNA Direct Blood 이외의 제품 사용시 필수)
1. UV Spcetrophotometer 이용 2. 전기영동을 이용한 반정량 방법 1) 준비물 – 농도를 알고 있는 DNA (외국정도관리 검체, control DNA) 2) 방법 – 1번 well : 200 ng에 해당하는 DNA - 2번 well : 정량하고자 하는 DNA 1 ul - 3번 well : 정량하고자 하는 DNA 5 ul - 4번 well : 정량하고자 하는 DNA 10 ul 3) 정량 - 1번 well의 band intensity가 2번과 3번 well의 중간쯤 - 따라서, (1+5)/2 = 3 ul가 200 ng volume

DNA Extraction 주의 사항 WBC가 부족한 경우 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation
- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 WBC가 부족한 경우 - 항암제를 투여 받은 Leukemia 환자 - 신장 투석 환자 - 이들 환자 검체의 경우 반드시 WBC수를 확인한다. - 정상범위 ; 성인 4000 ~ 10,000/ ul ; 15세 이하 유아 10,000 ~ 12,000/ul

Red Cell Lysis Buffer (5X)
DNA Extraction 주의 사항 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 I. WBC가 4,000개 이상의 정상 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C에서 1개월 보관 가능) Red Cell Lysis Buffer (5X) # of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentrate (μl) 200 410 620 830 1040 1250 1460 1670 1880 2090 H2O (ml) 0.80 1.64 2.48 3.32 4.16 5.00 5.84 6.68 7.52 8.36 Washing Buffer (10X) 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35

DNA Extraction 주의 사항 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation
- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 I. WBC가 4,000개 이상의 정상 환자 1. blood sample을 2~3초간 vortex 후, ㎖ E- tube에 100㎕ 혈액을 분주 3. 1x Red Cell Lysis Buffer 1㎖을 넣고 inverting하면 RBC가 용해되어 맑게 됨 4. 실온에서 5 분간 incubation 5. 13,000 rpm에서 1분 원심분리 → 백혈구 모음 6. 상층액 제거 후 Vortexing 7. Resuspended Dynabead 200㎕ (1 units) 첨가 후 pipetting 8. 5분간 실온 incubation

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 I. WBC가 4,000개 이상의 정상 환자 9. MPC-S에서 1 분간 방치 10. 상층액이 맑아지면 상층액 제거 후 MPC에서 분리 11. 1x Washing buffer나 D.W. 1㎖ 첨가 12. 7~9 과정 2회 반복 13. MPC에서 분리 후 200㎕ Resuspension Buffer나 D.W. 첨가 14. Pipetting 반복하여 complex 분리 15. 15㎕을 PCR 주형으로 사용

Red Cell Lysis Buffer (5X)
DNA Extraction 주의 사항 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 2,500 ~ 4,000개인 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C에서 1개월 보관 가능) ; 정상환자의 경우보다 Red Cell Lysis buffer를 2배 준비 Red Cell Lysis Buffer (5X) # of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentrate (μl) 410 830 1250 1670 2090 2500 2920 3340 3760 4180 H2O (ml) 1.64 3.32 5.00 6.68 8.36 10.00 11.68 13.36 15.04 16.72 Washing Buffer (10X) 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 2,500 ~ 4,000개인 환자 1. blood sample을 2~3초간 vortex 후, ㎖ E- tube에 100 ㎕ 혈액을 분주 3. 1x Red Cell Lysis Buffer 1㎖을 넣고 inverting하면 RBC가 용해되어 맑게 됨 4. 실온에서 5 분간 incubation 5. 13,000 rpm에서 1분 원심분리 → 백혈구 모음 6. 상층액 제거 후 Vortexing 7. 2~5 단계 1회 반복 8. Resuspended Dynabead 200㎕ (1 units) 첨가 후 pipetting

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 2,500 ~ 4,000개인 환자 9. 5분간 실온 incubation 10. MPC-S에서 1 분간 방치 11. 상층액이 맑아지면 상층액 제거 후 MPC에서 분리 12. 1x Washing buffer나 D.W. 1㎖ 첨가 13. MPC에서 1분간 방치 14. 11~13 과정 2회 반복 15. MPC에서 분리 후 200㎕ Resuspension Buffer나 D.W. 첨가 16. Pipetting 반복하여 complex 분리 17. 15㎕을 PCR 주형으로 사용

DNA Extraction 주의 사항 주의사항 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation
- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 2,500 ~ 4,000개인 환자 주의사항 반드시 blood 100 ul에 Red Cell lysis buffer 1 ml의 비율로 처리 * blood 200 ul에 Red Cell lysis buffer 1 ml 첨가 시 1) DNA purity가 감소되고, 2) PCR시 non-specific amplification 즉, false positive band의 원인이 된다.

DNA Extraction 주의 사항 III. WBC가 1,000 ~ 2,500개인 환자
WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 III. WBC가 1,000 ~ 2,500개인 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C에서 1개월 보관 가능) ; Red Cell Lysis buffer I & II 준비 - Red Cell Lysis buffer I : Red Cell Lysis concentrate 10:1 희석 : 0.5 M EDTA 첨가 - Red Cell Lysis buffer II

Red Cell Lysis Buffer II
DNA Extraction 주의 사항 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 1,000 ~ 2,500개인 환자 Red Cell Lysis Buffer I # of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentrate (μl) 100 220 320 420 540 640 740 840 940 1040 H2O (ml) 0.88 1.848 2.728 3.608 4.576 5.456 6.336 7.216 8.096 8.976 0.5 M EDTA (μl) 20 42 62 82 104 124 144 164 184 204 Red Cell Lysis Buffer II 0.9 1.89 2.79 3.69 4.68 5.58 6.48 7.38 8.28 9.18 Washing Buffer 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 1,000 ~ 2,500개인 환자 1. blood sample을 2~3초간 vortex 후, ㎖ E- tube에 500 ㎕ 혈액을 분주 3. Red Cell Lysis Buffer I 1㎖을 넣고 inverting하면 RBC가 용해되어 맑게 됨 4. 실온에서 5 분간 incubation 5. 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 → 백혈구 모음 6. 상층액 제거 후 Vortexing 7. Red Cell Lysis Buffer II 1㎖을 넣고 1분간 Incubation 8. 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 상층액 제거

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 II. WBC가 1,000 ~ 2,500개인 환자 9. Vortexing 후 Resuspended Dynabead 200㎕ (1 units) 첨가 10. Pipetting 후 즉시 새로운 E-tube로 옮긴 후, 5분간 실온 incubation 11. MPC-S에서 1 분간 방치 12. 상층액이 맑아지면 상층액 제거 후 MPC에서 분리 13. 1x Washing buffer나 D.W. 1㎖ 첨가 14. MPC-S에서 1분간 대기 15. 12~14 과정 2회 반복 16. MPC에서 분리 후 200㎕ Resuspension Buffer나 D.W. 첨가 17. Pipetting 반복하여 complex 분리 18. 15㎕을 PCR 주형으로 사용

DNA Extraction 주의 사항 IV. WBC가 1,000개 이하인 환자
WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 IV. WBC가 1,000개 이하인 환자 ; Dynabeads DNA Direct Blood 시약 준비 (2~8C에서 1개월 보관 가능) ; 1 ml whole blood (500 ㎕ x 2 tubes)에서 DNA extraction ; Red Cell Lysis buffer I & II 준비 - Red Cell Lysis buffer I : Red Cell Lysis concentrate 10:1 희석 : 0.5 M EDTA 첨가 - Red Cell Lysis buffer II

Red Cell Lysis Buffer II
DNA Extraction 주의 사항 WBC가 부족한 검체로부터 DNA Isolation - Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 IV. WBC가 1,000개 이하인 환자 Red Cell Lysis Buffer I # of Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentrate (μl) 210 440 640 840 1080 1280 1480 1680 1880 2080 H2O (ml) 1.848 3.696 5.456 7.216 9.152 10.912 12.672 14.432 16.192 17.952 0.5 M EDTA 42 84 124 164 208 248 288 328 368 408 Red Cell Lysis Buffer II 1.89 3.78 5.58 7.38 9.36 11.16 12.96 14.76 16.56 18.36 Washing Buffer 300 630 930 1260 1560 1890 2190 2520 2820 3150 2.7 5.67 8.37 11.34 14.04 17.01 19.71 22.68 25.38 28.35

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 IV. WBC가 1,000개 이하인 환자 1. blood sample을 2~3초간 vortex 후, ㎖ E- tube 2개에 각각 500 ㎕ 혈액을 분주 3. 각각의 tube에 Red Cell Lysis Buffer I 1㎖ 첨가 4. 수회 inverting 후, 실온에서 5 분간 incubation 5. 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 → 백혈구 모음 6. 상층액 제거 후 Vortexing 7. 각각의 tube에 Red Cell Lysis Buffer II 1㎖ 첨가 8. 1분간 incubation 9. 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 상층액 제거

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 IV. WBC가 1,000개 이하인 환자 10. Vortexing 11. 한 tube에 Resuspended Dynabead 200㎕ (1 units) 첨가 12. Pipetting 후 즉시 나머지 E-tube로 옮긴 후, 13. Pipetting 후 즉시 새로운 E-tube로 옮김 Tube 1 Tube 2 Tube 1 Add 200 ul Dynabeads Pipetting & Transfer to tube2 Tube 2 Transfer to New E-tube New E-Tube

- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 IV. WBC가 1,000개 이하인 환자 14. 5분간 실온 incubation 15. MPC-S에서 1 분간 방치 16. 상층액이 맑아지면 상층액 제거 후 MPC에서 분리 17. 1x Washing buffer나 D.W. 1㎖ 첨가 18. MPC-S에서 1분간 대기 19. 16~18 과정 2회 반복 20. MPC에서 분리 후 200㎕ Resuspension Buffer나 D.W. 첨가 21. Pipetting 반복하여 complex 분리 22. 15㎕을 PCR 주형으로 사용

DNA Extraction 주의 사항 V. WBC가 많은 환자 WBC가 많은 검체로부터 DNA Isolation
- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 V. WBC가 많은 환자 - 만성 백혈병 또는 백혈병양반응 (Leukemoid reaction) - 50,000/ul 이상으로 증가 - 이들 환자 검체의 경우 반드시 WBC수를 확인한다. - 정상범위 ; 성인 4000 ~ 10,000/ ul ; 15세 이하 유아 10,000 ~ 12,000/ul

DNA Extraction 주의 사항 WBC가 많은 검체로부터 DNA Isolation V. WBC가 많은 환자
- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 V. WBC가 많은 환자 - Blood volume을 줄여서 Normal Protocol 사용 ; 10,000 cell/ ul 양으로 줄여 사용 (예 참조) - 100 ul blood 사용시 문제점 ; WBC가 많아 충분한 cell lysis가 되지 않아, PCR이 제대로 되지 않는 경우가 발생 ; DNA가 bead의 binding capacity를 벗어나기 때문에 pipetting시 DNA가 딸려 나오는 불편함

DNA Extraction 주의 사항 WBC가 많은 검체로부터 DNA Isolation V. WBC가 많은 환자
- Dynabeads DNA Direct Blood 사용시 V. WBC가 많은 환자 예) WBC가 50,000 cells/ ul 개인 환자 - 10,000 cells/ ul가 되려면 1/5 volume만 사용 - 즉, 100 ul whole blood 대신 20 ul 사용 - 50,000 x 20 = 10,000 x 50

Hybridization & Detection 주의 사항
PCR product 정확한 시약 조제 정확한 온도 시간 준수 Important Serious !!! &

1. 시약 준비 - Protocol에 언급된 대로 정확한 희석배수를 지킨다. - Working hybridization buffer, Wash buffer 및 Citrate buffer는 조제 후 3개월간 실온에서 안정 - Contamination에 주의

2. Pre-hybridization 처리 - Dynal RELI SSO는 50±1C의 온도에서 안정적 - 온도에 영향을 주는 주변환경이 매우 중요하다 ; Tray에 Strip을 넣는다 ; Hybridization Buffer를 첨가한다 ; Tray를 Waterbath 에 위치시킨다 ; 50C water bath에서 10분 이상 Warming 해준다 - 비교적 온도 변화가 없는 장소에 Water Bath를 설치

Water bath 온도 QC > 50 – False negative 증가 < 50 – False positive 증가 1. water bath 온도를 calibration하고, 2.일반 온도계를 이용하여 매일 온도 check를 하고, 기록 - ex) 온도를 calibration 한 후 일반 온도계의 온도가 51℃이면 지속적으로 51℃를 확인. 만일 52℃를 나타낸다면 온도가 1℃ 틀리므로 water bath를 49℃에 맞춰서 사용하고 즉시 웅비에 연락을 해서 water bath 온도를 calibration 한다.

3. Denatured DNA 첨가 - 반드시 Tray를 water bath내에 위치 시킨 상태에서 첨가한다 - 절대로 probe위에 직접 loading하지 않고, - Tray 제일 아래에 loading 한다 4. Hybridization 1) Cross-contamination 주의 - 절대로 buffer가 서로 넘치지 않도록 주의할 것 2) Tray cover와 Tray 사이로 물이 스며들 경우 - 우선 반응을 중지한 후 Lab tissue를 tray와 cover 사이에 대어 물을 흡수한 후 tray cover를 열고 나머지 물을 닦아낸다 - 절대로 당황해서 바로 tray cover를 열지 않는다

5. Stringent Wash - 시간 및 온도 준수 - Hybridization & Detection 과정에서 Key Step ; Dynal Package Insert P. 12. Note 참조 - 특히, 오랜 시간 stringent wash를 할 경우 hybridized probe이 모두 제거됨

6. SA-HRP 조제 - 사용 전, 15분 이내에 조제할 것 ; Dynal Package Insert P. 13. Note 참조 ; 즉, Stringent Wash Step에서 준비할 것 - HRP는 enzyme이기에 실온에서 오래 있을 경우 activity 감소 * HRP 첨가 후 4C에 보관하지 말 것 - 반드시, 실온에서 SA-HRP 반응을 할 것 7. Citrate buffer의 역할 - High background의 원인이 되는 SDS제거 - Substrate 발색에 필요한 최적의 pH 상태 조성 및 유지 - Color 유지

8. Assay time - 반드시 protocol 이 언급한 시간만큼 실시할 것 - Substrate incubation을 오래 하면 전체적으로 푸른 빛을 띠는데 이 때는 D.W.에서 푸른 빛이 사라질 때까지 washing을 해준다 9. Strip의 보관 - 공기와 접촉은 TMB substrate가 산화되어 탈색의 원인이 된다 - Strip이 건조된 후, 투명 tape를 이용하여 공기와 접촉을 막는다 10. Tray의 보관 - 실험 후 반드시 Et-OH를 이용하여 substrate를 완전히 제거한 후 물로서 washing 한 후 건조시킨다 - 세제 사용은 절대금지

False Band가 보고된 Case False Band의 빈도가 높아진 경우 조치사항
1. DNA concentration & Quality Check (Dynal 사용 경우) - Cell 수 확인 - Normal range의 경우 DNA extraction을 다시 하되, - F.M. 대로 할 것 - Dynal 제품을 사용하는 경우에는 대부분 washing step에서 solution 제거가 불충분하여, 낮은 순도의 DNA가 False band의 원인

False Band가 보고된 Case False Band의 빈도가 높아진 경우 조치사항
2. DNA concentration & Quality Check (타사 제품 사용 경우) - Qiagen, Promega, Gentra 및 Home made methods를 사용하는 경우는 대부분 너무 많은 양의 DNA를 사용하는 것이 false band의 원인 - False band가 나와서 interpreatation에 의심이 가는 경우는 우선 DNA 정량을 한다. - DNA 정량 결과, Quality가 양호하면 ; DNA 농도를 확인하여 200 ~ 300 ng의 DNA를 PCR에 사용한다. - Ratio가 1.5 이하 또는 2.2 이상이면 DNA extraction을 FM대로 다시 한다.

False Band가 보고된 Case False Band의 원인을 찾기 위한 실험 순서
Step 1. Sample DNA, (+) Control & (-) Control (D.W.) 각각 PCR 실시 Step 2. 5 ul씩 PCR product 전기영동 실시 - Control DNA의 PCR product와 같거나 높은 intensity ; Detection step으로 - Sample DNA의 PCR product보다 낮은 intensity ; Sample DNA 문제 - 모든 PCR product가 나오지 않음 ; PCR machine 이상 - Negative control에서 band detection ; 사용중인 시약 contamination, 모두 교체할 것

False Band가 보고된 Case Step 3. Step 1, 2에서 이상이 없는 경우 detection
- 만일, 결과에 문제가 생기면 ; 온도 문제 ; 시약 조제의 문제를 생각할 수 있다. - 이상의 모든 step에서 반드시 Control DNA (+/-)를 세워야 한다.

False Positive가 보고된 Case
I. HLA-DRB 27,28,29번의 weak false positive 1. 27,28,29 probe의 경우 True이면 매우 강한 band intensity (Control band보다 2.5배 이상)를 보임 따라서, 2배 이하이면 무시 참고1) 27번 probe와 관련이 있는 08023,0810,0823 allele 및 1201,1206 allele은 한국인에 흔한 allele임 참고2) 28,29번 probe는 한국인에 없거나 매우 드문 allele관련 따라서 28,29번은 한국인에서 거의 나오지 않음

I. HLA-DRB 27,28,29번의 weak false positive 4. 27,28,29번 probe가 weak false positive인 경우 Control < 2배 5. 27,28,29번 probe의 true positive인 경우 Probe 27 Control probe Probe 28 Probe 29 Control > 2.5배

II. HLA-DRB 31번의 weak false positive 1. 2번 band가 positive일 경우 발생 1) DRB1*15일 경우 31번 probe의 false positive가 보고 되었음 (Dynal 본사) - 이는 DRB1*15의 antisense primer (3' end)와 31번 probe의 5 base가 overlap되었기 때문 - 따라서 DRB1*15가 나올 경우 증폭된 antisense primer의 끝부분이 31번 band와 hybridization이 일어나 weak positive signal 발생 가능 2. 그러나 31번 probe는 DRB1*0401 group과 관련이 있고, true이면 매우 강한 band intensity (Control보다 2배 이상)를 보임 따라서, DRB1*0401 & 15일 경우를 제외하고는 31번 probe은 무시

III. HLA-DRB 2번과 36,37번의 weak false positive 1. 2번은 DRB1*15와 16에 관련된 probe로서 2번이 증폭되어야 36번 37번이 true band이다. 2. 만일 2번이 증폭이 되지 않았으면 36번, 37번 probe는 결과에 영향을 미치지 못한다. 즉 2번이 증폭되지 않으면 36,37번은 무시 3. PMP에서는 2번 probe를 positive로 인정하면 36,37번 probe 부분이 녹색으로 나타나며, 4. 만일 2번 probe를 표시하지 않으면 36,37번 probe 부분이 회색으로 typing에 영향을 미치치 않는 부분으로 표시됨 5. 36 번 probe는 DRB1*15 confirm 37 번 probe는 DRB1*16 confirm 6. 한국형 프로그램 사용시는 2번 probe가 나오지 않았을 경우에 36, 37번을 넣지 말것

IV. HLA-A 3번의 weak false positive 1. 3번은 A*24 Allele과 Cross Reaction - A*24일 경우 3번 probe의 false positive가 보고 되었음 (Dynal 본사) - 이는 A*24의 primer와 31번 probe가 overlap되었기 때문 - 따라서 A*24가 나올 경우 증폭된 primer의 끝부분이 3번 probe와 cross-hybridization이 일어나 weak positive signal 발생 가능 2. 3번 probe – A*01,02,03,32 allele과 관련이 있으며, 이 allele과의 조합 이외에서 3번 probe이 약하게 나오면 무시 3. 3번 probe과 관련이 있는 allele이 나오는 경우, 즉 true이면 매우 강한 band intensity (Control에 비해 2배 이상)를 보임

V. HLA-B 27, 31번의 weak false positive 1. 27, 31번은 B*44 Allele과 Cross Reaction - B*44일 경우 27, 31번 probe의 false positive가 보고 되었음 (Dynal 본사) - 이는 B*44의 primer와 27, 31번 probe가 overlap되었기 때문 - 따라서 B*44가 나올 경우 증폭된 primer의 끝부분이 27, 31번 band와 hybridization이 일어나 weak positive signal 발생 가능 2. 27번 probe – B*51, 57, 58과 관련 31번 probe – B*15, 18, 38, 39, 40과 관련이 있으므로, 이 allele과의 조합 이외에서 27,31번 probe이 나오면 무시 3. 27, 31번 probe와 관련 있는 allele이 나오는 경우 즉, true이면 27, 31번 probe은 매우 강한 band intensity (Control의 2배)를 보임

False Negative가 보고된 Case
VI. HLA-B 32번의 weak false negative 1. B*07에서 32번 probe의 weak한 경향 - B*07일 경우 32번 probe에서 weak한 경향을 보임 - Scanner를 사용한 interpretation의 경우 false negative로 판정하는 경우가 있음 - 그러나, Intensity Reference probe와 거의 같은 정도의 intensity를 보인다. 2. 따라서, control probe보다 약간 약하더라도 positive probe로 인정할 것

Woongbee Ambiguity Data
I. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 Ambiguity HLA-A Amb1 1. Positive Probe – 1,4,5,9,10,11,14,18,19,22,24,26,28,30,32,36,38,40 2. Result – HLA-A*30 & 68 or 30 & 33 3. 한국인에서 발현빈도가 높은 HLA-A allele A*30 – 3001 (76.6%), 3004 (23.4%) A*33 – 3303 (100%) 4. Interpretation A*3009가 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*30 & 33으로 Report 가능

I. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 Ambiguity HLA-A Amb1

II. HLA-A*01 & 02 or 02 & 26 Ambiguity HLA-A Amb2 1. Positive Probe – 3,5,6,11,13,15,19,22,23,25,26,30,34,36,38,39,40 2. Result – HLA-A*01 & 02 or 0236 & 3604 3. 한국인에서 발현빈도가 높은 HLA-A allele A*02 – 0201 (56.5%), 0203(1.5%), 0206(31.2%), 0207 (10%), 0210 (0.4%) 4. Interpretation A*0236과 36은 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*01 & 02로 Report 가능

II. HLA-A*30 & 33 or 30 & 68 Ambiguity HLA-A Amb2

III. HLA-A*01 & 02 or 02 & 26 Ambiguity HLA-A Amb3 1. Positive Probe – 3,6,9,10,11,13,14,19,23,24,26,28,30,36,38,40 2. Result – HLA-A*02 & 33 or 0255 & 7404 3. 한국인에서 발현빈도가 높은 HLA-A allele A*02 – 0201 (56.5%), 0203(1.5%), 0206(31.2%), 0207 (10%), 0210 (0.4%) A*33 – 3303 (100%) 4. Interpretation A*0255가 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*01 & 02로 Report 가능

III. HLA-A*02 & 33 or 02 & 74 Ambiguity HLA-A Amb3

IV. HLA-A*01 & 29 or 29 & 36 Ambiguity HLA-A Amb4 1. Positive Probe – 3,5,8,11,12,15,19,22,24,25,28,30,34,36,38,39,40 2. Result – HLA-A*01 & 29 or 2903 & 3604 3. Interpretation A*36은 한국인에서 발견되지 않았기 때문에 HLA-A*01 & 29로 Report 가능

IV. HLA-A*01 & 29 or 29 & 36 Ambiguity HLA-A Amb4

V. HLA-B*07 & 35 or 35 & 81 Ambiguity HLA-B Amb38 – 웅비로 반드시 검체를 보내는 경우 1. Positive Probe - 1,6,7,8,13,15,16,20,28,29,30,32,40,43,48,50,53,54, 56,60,61 2. Result – HLA-B*07 & 35 or 35&81 3. 한국인에서 발현 빈도가 높은 HLA-B alleles HLA-B*0705,0706 (0.5%) HLA-B*3502,3504,35091,35092,3515 (0.1%) HLA-B*3508 (0.1%) HLA-B*8101 (0.1%) 4. Interpretation 한국형 결과 300 : 1 이상의 빈도 차일 경우 실험 의뢰 그 이하일 경우는 Most Probable로 Report 가능

V. HLA-B*07 & 35 or 35 & 81 Ambiguity HLA-B Amb38 – 웅비로 반드시 검체를 보내는 경우 5. PMP 결과 6. 한국형 program 결과

Woongbee New Data HLA-DRB1*1203 HLA-DRB3*0106/0107 1. 한국인에서 보고된 적은 없음
2. 그러나, Asian에서 0.27% (26.6/10,000)정도로 보고 3. 따라서, 드물게 나올 수 있음 HLA-DRB3*0106/0107 1. 한국형 프로그램에서 Rare 2. DRB1*1201-DRB3*0106/0107 (2 Case 보고 – 서울대 병원) ; 모두 A2-B70-DRB1*1201 haplotype을 가지고 있었음 3. DRB3*01 New로 보고 (Human Immunology 보고에 기술) 4. Reference : Song E.Y. et.al., HLA-DRB1 and –DRB3 allele frequencies and haplotypic associations in Koreans. Human Immunology. 2004; 65; 270~276

한국인의 HLA-A, B, DR 형별 빈도 2003년 춘계학술대회 발표 서울대학교 노은연 외 HLA-A (13종) GF(%)
HLA-B (31종) HLA-DR A01 A02 A03 A11 A23 A24 A26 A29 A30 A31 A32 A33 A68 ABL 1.9 28.6 10.3 †0.0 22.3 6.6 0.6 4.8 5.6 0.9 16.3 0.2 0.0 B07 B08 B13 B14 B27 B35 B37 B38 B39 B44 B46 B47 B48 B49 B50 B51 B52 B54 B55 4.4 1.2 2.8 6.0 1.5 1.1 10.0 4.6 3.3 0.1 6.2 B56 B57 B58 B59 B60 B61 0.3 6.7 1.8 4.3 ‡9.2 DR01 DR03 DR04 DR07 DR08 DR09 DR10 DR11 DR12 DR13 DR14 DR15 DR16 DRBL 6.9 19.5 6.5 10.2 9.8 1.7 5.1 7.3 11.0 8.0 11.1 B4002 B4003 B4006 4.7 0.7 3.8 B62 B63 B67 B71 B75 10.1 2.1 B1502 B1511 B81 BBL

한국인의 2 유전자좌 일배체형 분포 HF≥1.0% and LD with chi square≥6.63 (P<0.01)
A-B (23종) HF(%) ChiSQ A33 A02 A24 A30 A11 A26 A31 A01 B44 B58 B46 B51 B13 B52 B07 B62 B54 B35 B61 B27 B48 B75 B60 B37 B14 B59 B39 7.5 5.8 3.0 2.9 2.8 2.7 2.5 2.3 1.7 1.6 1.5 1.4 1.2 1.1 1.0 902.0 843.6 102.5 10.7 1061.3 259.2 151.9 108.2 39.3 8.0 77.3 53.0 39.0 13.1 53.1 47.7 45.9 7.9 1439.1 739.0 45.4 34.2 7.3 A-DR (18종) HF(%) ChiSQ A33 A24 A02 A11 A30 A31 A26 A01 DR13 DR04 DR08 DR15 DR01 DR12 DR07 DR11 DR03 DR09 DR14 DR10 7.9 5.4 4.6 4.2 3.6 3.0 2.9 2.5 2.4 2.1 1.4 1.3 1.2 1.0 895.3 12.6 50.5 53.3 59.1 62.4 15.1 79.0 27.5 387.8 134.0 44.6 43.5 33.4 15.9 17.7 31.0 915.8 B-DR (25종) HF(%) ChiSQ B44 B62 B58 B07 B46 B52 B13 B61 B54 B27 B59 B51 B37 B35 DR13 DR04 DR01 DR08 DR15 DR07 DR09 DR14 DR03 DR10 DR12 5.1 5.0 4.0 3.4 2.9 2.8 2.7 2.5 2.4 2.0 1.8 1.7 1.6 1.5 1.3 1.2 1.1 1.0 589.5 214.0 541.2 1163.0 476.1 587.7 242.8 576.6 109.4 50.1 632.5 61.3 679.7 177.3 7.0 10.7 2054.9 72.3 10.8 9.3 9.1 10.5 8.4 21.0 7.9 Bold: chi square>500

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