Instrumental Analysis

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1 Instrumental Analysis
UV/vis 흡수분광법 (Skoog. 14장)

2 에너지의 크기와 분광분석 UV/Vis Theory 분자의 전체의 전이에너지:
Etotal= Eel (전자전이) + Evib (진동E) + Erot (회전E) + Etrans(병진 E) 한 개의 전자전이 에너지는 몇 개의 진동에너지 합과 유사하고, 한 개의 진동에너지는 몇 개의 회전에너지의 합과 유사하다. 즉, 이들의 에너지 크기 관계는: Eel> Evib> Erot 따라서 다음의 관계가 성립한다

3 전자전이와 에너지 UV/Vis Theory 흡광전자: 복사선 흡수와 관계 있는 전자.
원자 사이의 결합형성에 직접 참여하는 전자  산소, 할로겐, 황, 질소 원자 주위에 있는 비결합 또는 비공유전자. No-binding electron (n전자)   결합, 결합  Sigma 결합: 단일 공유결합 C  H 강하게 결합되어 있다. 강한 에너지가 여기에 필요(안정되어 있다)  Pi 결합: 2중 공유결합  -  결합  -  결합 2중 결합은 , 결합의 혼합 C  H  비교적 안정 8개

4 UV/Vis Theory  n전자: 산소, 할로겐, 황, 질소 등의 비공유 전자쌍 n전자 (비교적 불안정, 노총각전자) 
sigma결합 H 분자의 전자 에너지 준위  전자분포: SKOOG 그림 14-1 (계단모양설명) * 反결합전자 * 反결합전자 4종의 전자전이 형태가 존재     n 비결합전자  결합전자  결합은 강하게 결합되어 안정성이 크므로, 여기에는 강한 에너지가 필요하고 이렇게 흡수된 강한 에너지는 여기 상태에서 존재하므로 그림처럼 높은 에너지 준위를 갖는다.외우지 말고 이해를 하자.  결합전자 전자전이에 필요한 에너지의 크기는  >  >  >  의 순서이지만, 일반적으로  , 은 명확하게 구분하지 않지만 n* 가 보통 조금 크다. 가 조금 크다는다. 즉, Excitation이 쉽게 일어나는 것은 이 에너지 크기의 역순이다. 파장과 에너지?

5 UV/Vis Theory  그러면, 모든  결합은 여기 에너지가 같다는 말인기요?
No, I did not say such a thing! 결합수 와도 관계가 있다.  Sigma 결합: *전이 C  H 결합 4개: max 125 nm (C-H bond) H 결합 7개: max 135 nm (C-H, C-C bond) C  H  H  C   H 여기에 필요한 에너지는 구성원자의 수와 종류와도 관계한다. 예를 들면 같은 결합수라면 C-H bond가 C-C bond보다 더욱 안정. 즉, E. of 125 nm > E. of 135 nm 흡수파장 피크로서 결합의 안전성 판단 가능

6 UV/Vis Theory  n* 전이 :
max < 200 nm (예, H2O, CH3OH, CH3Cl 등 교과서 표 14-2 참고)  * 전이(발색) & n*전이(조색): 200 < max < 700 nm (색소화학) 약한 띠 max는 봉우리의 세기를 의미(106 최대) 강한 띠

7 UV/Vis Theory E2 vs B 그리고 슬릿너비효과 B E2
슬릿너비효과(나비가 적으면 뚜렷해짐) E2 band :2s+2P 블록의 전이, B(bulk): 대부분의 분자구조에서의 전이. 탄소화합물은 모두 나옴 더 자세한 사항은 교과서“밴드이론”참고

8 UV/Vis Theory 발색단(chromophore): 분자가 색깔을 띠게 하는 작용기(n전자,  전자 등 불포화 작용기에 의한 전이). 넓은 의미: 화합물이 빛을 흡수하여 모든 종류의 전자전이를 일으키게 하는 작용기. 발색단: 발색단의 전자 전이는 용매에 따라 다르다. 교과서 표 참고(14-1, p341) 여기에 대한 규칙은, 용매의 극성  Blue shift Red Shift n* 전이 * 전이 (물, 에탄올 등) 왜 그럴까? 발색단을 이용한 단백질 농도 측정법:Lowry Assay REPORT!!

9 UV/Vis Theory 조색단(auxochromophore)
발색단이 빛을 흡수하는데 도움을 주는 작용기. 그 자신은 흡수하지 않는다. 산소, 할로겐, 황, 질소 원자 주위에 있는 비결합 또는 비공유전자 ex) -OR, -NH2, -NR, -OH, -X 발색단과 결합, 흡수파장을 장파장으로 이동(Red Shift), 흡수세기증가 N H C O H C 파장 Abs 조색단 피크 고에너지 max 예) Benzene nm Phenol nm (비공유 2) Aniline nm (비공유 1) 조색단의 비공유가 2개면 1개보다 장파장에서 흡광해야 하는 것 아닌가? 다음페이지 참고 발색단의 conjugation: 발색단의 수와 파장 탄소의 수를 알 수 있다. C C C C C 중심체 2개 중심체 3개 높은 에너지로 여기 가능 낮은 에너지로 여기 가능 Red shift (흡수체가 많다)

10 참고: 조색단의 전기음성도와 관련하여 흡광피크가 차이가 있게 된다.
결합에 관여하는 조색단 주원자의 전기음성도가 크면 결합전자는 주원자 가까이에 위치하여 전자구름의 밀집도가 높아지게 되어 전자결합이 에너지를 흡수할 수 있는 공간점유가 작아지고, 진동파수가 커진다고 할 수 있다.

11 UV/Vis Theory 피크의 유무(괴로운 멜라닌색소)
인간의 eumelanin의 구조식의 일부 멜라민 색소가 많은 피부는 UV파장이 아니더라도 nm의 흡수를 한다. 이는 다양한 발색단과 많은 조색단이 있기 때문이다. 피크의 존재는 여기 상태로의 전환을 의미하며 작용기 숫자가 적을 때 일어난다. 주: 작용기의 종류가 많아 지면 바닥상태로 떨어지기 어렵고(왜 그럴까?) 따라서 열에너지가 많이 발생하게 된다.

12 Instrumental Analysis
UV/vis Experiment (Skoog. 14장) 기기분석의 목적: 정성분석, 정량분석 광학분석의 목적: 정성분석, 정량분석

13 분석기기사용실태 2008년 10월 8일 촬영 4학년 1학기부터 학부생들이 사용

14 PSA(입도분석기) 현재 관이 막혀서 사용불가

15 UV/vis

16 DSC(열분석기) 셀이 부분파손됨 3개째+IR용 샘플제작기(2009년 1학기 파손)

17 GC(가스크로마토그래피)

18 HPLC(고성능액체크로마토그래피)

19 시약

20 FTIR 2007년 학생의 부주의로 내부창이 파손되어 새로 구입(6천만원)
2013년 고장(검출기 및 PowerSupply: 수리비 800만원)

21 흡광도 측정시 중요사항 UV/Vis Experiment 용매선택 가시광선: 모든 무색 용매 사용
자외선: H2O, 95% EtOH, Cyclo-hexane  용매는 투명하고 흡광 물질의 흡광 특성에 영향을 주지 않는 물질. 극성 용매는 용질의 진동 효과 스펙트럼 제거(SKOOG 그림14-1) 탄화수소와 같은 비극성 용매 사용 (SKOOG 그림14-6)  흡수 극대점도 용매에 의해 변화 (Red, Blue shift).  샘플이 많을 때는 같은 용매를 사용하여야 분석에 편리.  자외선 가시광선 용매 SKOOG 표 14-3(다음페이지)

22 UV/Vis Experiment SKOOG 그림 14-1: 용매의 선택과 흡수스펙트럼 특성

23 UV/Vis Experiment SKOOG 그림 14-6: 극성의 크기와 스펙트럼 극성이 강하면 더 폭이 넓다.

24 UV/Vis Experiment SKOOG 표 14-3: 범용용매의 사용가능 영역

25 UV/Vis Experiment 파장 일반적으로 적은 농도변화에 대하여 흡광도 변화가 적은 파장을 선택.
미묘한 변화에 대한 대응 및 실험영역을 넓게 할 수 있다. 스펙트럼의 도시 가로축은 파장, 세로축은 광학적 특성을 표시한다.  SKOOG 그림 14-10, 14-11 기본형 미분 흡광도는 산란효과 및 상세효과를 검증할 때 사용하는 경우가 있다.(교과서 참고 p )

26 흡광도 측정에 의한 정량 분석(교과서 p26, 실험적방법)
UV/Vis Experiment 흡광도 측정에 의한 정량 분석(교과서 p26, 실험적방법) Spectrum의 도시  보통 피장 vs (흡광도 OR 투광도)  간혹 파장 vs log(흡광도) 또는 파장 vs 미분흡광도 사용 알고자 하는 파장 영역을 선택하여 용액 속의 용질 농도에 따른 흡광도 측정 (즉, A= bc에서 c만 모르는 경우). 정량적 처리 0.15M Abs 0.1M 파장 1 2

27 UV/Vis Experiment 정량적 처리 (A= bc에서 ,c모두를 모르는 경우).
일반적으로 Beer의 법칙으로 적용한다 (’’ 을 알고 있을 때). ’’ 이 미지의 경우 표준물 첨가법 과 같은 기법으로 정량화 한다.  표준물 첨가법: 알고있는 표준물의 농도를 기준으로 정량화 하는 방법으로 표준물의 량을 변화시켜 실제 시료의 농도를 구한다. (교과서 1장 참고 p26)  표준 용액의 농도 (Cs), 량 (Vs) ex, 10 ppm hemoglobin  시료 용액의 농도 (Cx), 량 (Vx) ex, H2O내의 hemoglobin  시료의 량을 일정하게 한다. Ex, 10 cc, 20 cc.  샘플을 다음과 같이 다양하게 표준물의 량을 증가 시키는 방법으로 만든다. Sample 1: Vx= Vt (미지시료의 량=전체시료의 량) Sample 2: Vx + Vs = Vt2 (시료의 량에 동일한 량의 표준액 넣는다) Sample 3: Vx + 2 Vs= Vt3 Sample 4: Vx + 3 Vs=Vt4 중요: Vs를 독립변수화 시키고 있음. Sample 5: Vx + 4 Vs=Vt5 주의: 표준용액을 첨가함은 부피가 늘어남을 의미, 농도가 증가함을 의미하는 것이 아님. If, 1. 표준용액의 농도 > 시료의 농도 Vt5의 농도 > Vt4 > Vt3 > Vt2 > Vt1 Else 2. 표준용액의 농도 < 시료의 농도 Vt5의 농도 < Vt4 < Vt3 < Vt2 < Vt1

28 UV/Vis Experiment 1. 의 경우 전체 샘플에 대한 흡광도 변화는 다음과 같이 나타날 것이다.
1. 표준용액의 농도 > 시료의 농도 Vt5의 농도 > Vt4 > Vt3 > Vt2 > Vt1 Vt5 Abs 특정파장에서의 흡광도가 점점 커진다. Vt1(시료) 파장 2. 의 경우 전체 샘플에 대한 흡광도 변화는 다음과 같이 나타날 것이다. 파장 Abs Vt5 Vt1(시료) 2. 표준용액의 농도 < 시료의 농도 Vt5의 농도 < Vt4 < Vt3 < Vt2 < Vt1 특정파장에서의 흡광도가 점점 작아진다.

29 UV/Vis Experiment 이러한 샘플들에 대하여 Beer의 법칙을 적용하면(전체농도=표준용액+시료),
A=bCx + bCs (: 물질이 같으므로 같다, Cx, Cs는 섞여 있으므로 부분농도이다.) 즉, A= Vs는 알고 있는 농도이지만 실험시 계속 변화하므로(독립변수) 이에 대하여 정리하면 Vs에 대하여 1차식 A= ‘K’ ‘m’ = mVs + K Vs를 Vs, 2Vs, 3Vs로 바꾸어 주면 Vs에 대하여 흡광도는 직선. 즉) A= mVs + K m=0에서 y절편=K Abs 1 샘플Number

30 UV/Vis Experiment A= mVs + K A= ‘K’ ‘m’
실지로 y축 절편은 우리가 구할려는 값이지만, 그 값은 아직 알 수 없다. M 항과 K항은 공통적인 인수가 많으므로 K/m (절편/기울기)으로 단순화 해보면, K/m = = 우리가 알고자 하는 항은 Cx이므로 Cx에 대하여 전개하면 여기서, Cs, Vx, m은 알고 있는 수 이거나 실험을 통하여 구할 수 있다. 그러나 K는 y절편으로 알 수 없다. 즉, K를 알면 Cx를 알 수 있다. 다음 페이지 (K구하는 법)

31 UV/Vis Experiment 우리가 알고자 하는1번 샘플의 Cx는 다음의 두 가지 경우이다.
샘플 용액이 표준용액 보다 농도가 낮은 경우. Abs K 샘플Number 일치하지 않는 경우: 미실험 영역의 경우 수치적 해법에 의해 K를 구한다. UV/vis측정영역 밖의 농도인 경우 샘플 용액이 표준용액 보다 농도가 높은 경우. 일반적으로 같은 점 Abs K 샘플Number

32 UV/Vis Experiment 수치적 해법: 실험데이터가 아닌 가상의 데이터를 얻기 위한 수학적 방법.
최소 자승법: 정확한 상관관계(직선 혹은 곡선)을 얻기 위한 방법. 보간법: 정확한 데이터를 얻기 위하여 가공의 데이터를 만든다. 외삽법: 직선의 식(또는 곡선의 식)을 연장하여 데이터 영역 밖의 데이터를 추적. Excel, Sigma Plot, Origin, Mathematica, Matlab 등에서 할 수 있음. 컴퓨터 언어를 사용하여 구하는 것이 일반적임. 예제 14-1, 14-2 참고(p. 347) d, f전자 전이 금속계열의 전자전이 형태(p355~359). 교과서 참고 리포트: 요약(자필)

33 UV/Vis Experiment 실용예제: UV/vis를 이용한 Ca2+ 이온농도 측정
분필가루 (CaCO3) 를 물에 용해 하였을 때, 이온화 되는 Ca의 농도를 용해시간에 대하여 UV/vis로 측정하여 정량화 하라. 난용성 염이기 때문에 CaCO3를 녹이면 얼마나 해리되는 지 알 수 없다. Ca이온은 UV/vis 영역에서 흡광특성을 가지고 있지 않다. 이런 경우 발색단 및 조색단을 가지고 있는 물질(UV/vis영역에서 흡광특성을 가지는 물질)과 결합하는 Ca이온의 농도를 측정함 으로서 정량화가 가능하다. 그 과정은 분필가루는 이온화가 어려운 물질이기 때문에 CaCl2와 같은 물질로 이온화하여 Ca이온의 농도에 따른 흡광도 곡선을 측정한 후(calibration curve) 이를 기준으로 CaCO3중의 Ca이온의 농도를 알아낸다. 단 칼슘이온 몇 개가 발색단에 붙을 지 모르니 용해된 칼슘이온 농도보다 많은 결합사이트를 가질 수 있도록 발색단 농도를 조절하여야 한다. 일반적인 분석문제는 위의 경우처럼 제대로 된 이해가 없는 경우, 분석이 불가능한 경우가 많다.

34 UV/Vis Experiment Step 1: Ca2+이온과 결합하는 발색단을 가진 물질의 선택(Methyl Thymol Blue) Ca2+ 결합비=1:1  1:6(MTB의 농도에 의존) MTB의 구조 수용액에서 Na이온이 해리되면서 COO-이온형성: 4개 S=O 결합은 공유결합 형태로 이온화 하지 않지만, 전자밀도가 높아 여기에도 결합가능. OH는 염기성이 강하면 H+이온이 해리되어 나감. (결합사이트 7개) Ca이온이 붙는 것은 이온결합, 정전기적인력의 2가지 방법이다.

35 UV/Vis Experiment Step 2: CaCl2를 이용한 Ca이온 calibration(0.1 mM MTB사용)
칼슘농도와 흡광도는 1차식의 관계가 있다. 즉, 농도에 따른 흡광도는 하나의 값을 가진다. 632 nm에서의 흡광도의 크기는 Ca2+이온의 농도로 계산된다.

36 UV/Vis Experiment Step 3: CaCO3의 시간에 따른 이온해리도 측정
Error가 많은 영역: 대학원생의 실수 유사한 예로 단백질의 농도를 측정하는 Lowry assay의 방법이 있다.

37 Quiz: 다음현상의 원인은? 다음시간: 적외선 분광법의 기초 (SKOOG:16장)

38 Report는 수업시간 이미 냈습니다. 뭔가요?