Immunofluorescence Staining

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1 Immunofluorescence Staining
Neuroscience lab of addiction Jieun Kim

2 Background Principle 면역조직화학의 기법 중에서, 표지물질로서 형광물질을 이용하는 방법. 즉, 어떤 항원성을 갖는 물질의 세포 내 또는 조직 내에 있어서의 위치를 조사하고자 할 때, 그 물질에 대하여 특이적으로 결합하는 1차 항체를 반응시켜 그 반응 부위를 형광물질로 더욱 표지해 주어, 형광현미경으로 관찰하는 것이다. 1차 항체를 표지하는 직접법과 1차 항체를 항원으로 제작한 2차 항체를 표지하는 간접법이 있다.

3 종간 교차 반응성 (Species cross-reactivity)
Background Advantages and disadvantages 직접적(direct) 방법 간접적(indirect) 방법 시간 (Time) Direct IF는 한번의 결합 과정으로 진행되기 때문에 일반적으로 실험 시간이 짧음 일차 항체를 검출하기 위해 이차 항체를 사용하기 때문에 추가적인 단계가 필요 비용 (Cost) 형광 혹은 효소가 결합된(conjugated) 일차 항체는 일반 항체보다 가격이 더 높음 이차 항체는 일차 항체에 비해 비교적 비용이 저렴함. 하나의 이차 항체를 다른 종류의 일차 항체와 함께 사용하는 점이 비용을 더 절감할 수 있음 복잡성 (Complexity) 실험 단계가 적으므로 간단함 적절한 이차 항체를 선택해야 하므로 Complexity를 증가시킴. 특히 multi-color 실험에서 각각 다른 종과 형광을 선택해야 하므로 작업이 복잡해질 수 있음 유연성 (Flexibility) 시중에 판매되는 형광 또는 효소가 결합된 일차 항체의 종류가 다양하지 않으므로 사용에 제한이 있음 다양한 형광 또는 효소가 결합된 이차 항체의 사용은 실험에 큰 유연성을 부여함 민감성 (Sensitivity) 간적접 방법에 비해 시그널이 약할 수 있음. 직접적 방법에서는 이차 항체 사용에 의한 시그널 증폭이 일어나지 않기 때문 여러 이차 항체가 일차 항체와 결합함에 따라 시그널이 증폭됨 종간 교차 반응성  (Species cross-reactivity) 직접 방법은 fluorophore가 일차 항체와 이미 결합되어 있으므로 교차 반응이 최소화 됨 이차 항체는 타겟 이외의 다른 종과 교차반응 할 수 있음. Pre-adsorbed 이차 항체를 사용함으로써 이를 막을 수 있음 Background 결합된 일차 항체를 사용함으로써 비특이성 결합을 줄일 수 있음 샘플의 endogenous immunoglobulin은 high background의 원인이 됨

4 Background Type of fluorescence

5 1st Antibodies selection: It depends on the host species
Background 1st Antibodies selection: It depends on the host species

6 2nd Antibodies selection: It depends on filter of microscope
Background 2nd Antibodies selection: It depends on filter of microscope

7 Background filter of microscope

8 Repeated nicotine injections (1.0 mg/kg/day, 14 days, s.c.)
Results BDNF NeuN PSD95 BDNF+NeuN+PSD95 merge Repeated nicotine injections (1.0 mg/kg/day, 14 days, s.c.)

9 Results

10 Materials The rat brain section

11 Materials 1st Antibodies: NeuN (neuronal maker),
GFAP-594 conjugated (astrocyte maker), 2nd Antibodies: Alexa Fluor 488 Washing and dilution solutions: PBS (1M, 0.1M, 0.01M, pH.7.4) Blocking and solutions: BSA (bovine serum albumin), NGS (normal goat serum) Triton X-100 Pipettes (5 ml, 1 ml, 200 ul, 20 ul, 2.5 ul), conical tube (15 ml)

12 Method Day 1 Cutting and sample preparation
1. Microtome 의 필터 호스와 싱크대의 호스를 연결하여 물을 순환시킨다. -20℃까지 온도가 떨어지는지 확인한다. (만약 온도가 잘 안떨어진다면, 드라이아이스를 이용해서 Microtome상판의 온도를 떨어뜨려줌) 2. 24Well Plate 에 0.1% sodium azide/PBS 분주한다. 3. brain을 상판에 고정시키고 서서히 얼린다. 4. brain을 sectioning 해준다. 이때 Section 두께는 16 um 로 한다.

13 Method Day 2 IF-1 1. Washing step: PBS (1X, pH7.4)를 이용해 washing한다. (10min x 3번) 2. Blocking Step: 2st antibody의 host serum이 혼합된 *blocking solution을 이용하여 상온에서 1시간 blocking 해준다. (mild shaking) *Blocking solution (10 ml 기준 조성, 필요시 더 만들어 사용하면 됨) Goat {NGS (400ul)+BSA (10mg)+Triton X-100 (10ul)}/0.01M PBS(9590ul, pH7.4) = 10ml Goat +Donkey {NGS (400ul)+Donkey serum (400ul)+BSA (10mg)+Triton X-100 (10ul)}/0.01M PBS(9190ul, pH7.4) = 10ml

14 Method 0.1M PBS (pH 7.4) 10ml BSA 0.01g (10mg) Triton X-100 30ul
3. Washing step: PBS (1X, pH7.4) 를 이용해 washing한다. (10min x 3번) 4. 1st antibody incubation: IF용 1st antibody를 *antibody dilution buffer에 원하는 비율로 넣어 overnight (18~24h incubation, 4℃, 15~20rpm) 한다. *Antibody dilution buffer (10ml 기준 조성, 필요시 더 만들어 사용하면 됨) 0.1M PBS (pH 7.4) 10ml BSA 0.01g (10mg) Triton X-100 30ul

15 Method Day 3 IF-2 1. Washing step: PBS (1X, pH7.4) 를 이용해 washing한다. (10min x 3번) 2. 2nd antibody incubation: 원하는 파장대의 2nd antibody를 antibody dilution buffer에 넣어 은박지로 감싼 뒤 2시간동안 상온에서 incubation한다. (mild shaking) 3. Washing step: PBS (1X, pH7.4) 를 이용해 washing한다. (10min x 3번) 4. Slide glass에 brain section (2~3개)를 mounting 한 후 *mounting solution을 1~2방울 떨어트린 후 cover glass로 덮고 말린다. 5. Zeiss IF camera로 원하는 *filter에 맞춰서 관찰한다. Filter set Excitation Emission Fluorochromes Filter set 10 BP BP Alexa 488, FITC, Fluo-4, MitoTracker Green, Rhodamine 110, Rhodamine Green 등 Filter set 15 BP 546/12 LP 590 Propidium lodide (PI) 등 Filter set 49 G 365 BP 445/50 Alexa 350, DAPI, Hoechst33258 등

16 Next Week 결과보고서: 예비보고서:
자기가 IF 해보고 싶은 단백질의 localization을 확인하기 위해서 염색 해야할 단백질 2가지와 염색하기 위한 1st antibody, 2nd antibody를 조사하고 어떤 filter를 사용해야하는지 조사 예비보고서: Western immunoblotting의 원리 및 방법에 대해 조사