전자현미경 (Electron microscope)

Presentation on theme: "전자현미경 (Electron microscope)"— Presentation transcript:

1 전자현미경 (Electron microscope)
Section 1-6 포매 (Embedding) & 전자현미경 (Electron microscope)

2 Embedding(포매) Paraffin 용해통 및 분주장치 Paraffin warming chamber
Forcep warmer cold-plate 확대경 Warm-plate

3 Embedding(포매)

4 Embedding(포매) 포매의 목적 현미경표본을 만들고자 하는 조직은 크기가 매우 작은 것, 여러 조각으로 나눠진 것
박절에 적합한 강도가 일정치 않다는 점 조직 내부에 공간 또는 틈이 있어 박절 시 조직의 구조가 변형할 수 있다는 점 조직이 연하여 지지할 부위가 없다는 점 등으로 침투가 완료된 조직 자체를 직접 박절기에 단단히 고착시킨다는 것은 불가능 Embedding(포매)

5 포매의 목적 특수한 매질(포매제, embedding medium)을 사용하여 조직에 침투시켜, 조직전체를 일정한 형태로 경화시키고 동시에 조직 내 공간을 채워 조직의 구조적 변형이 발생하지 않도록 하는 과정 침투가 완료된 조직(병소부위)을 박절(cutting) 이 용이하도록 일정한 모양으로 만들어 주는 과정이며, 포매는 박절을 하기 위한 사전 작업 병소부위가 박절될 수 있도록 병소부위를 하향(박절면 방향)하여 포매 Embedding(포매)

6 Embedding(포매) Paraffin 포매 장점
단점 포매과정에서 사용되는 alcohol과 xylene과 같은 유기용매에 의해 지질이 용해되며, paraffin 침투 시 고온 (약 60℃)에서 수행해야 하므로 효소의 소실, 그리고 조직의 경화와 수축이 된다. Embedding(포매)

7 Embedding – specimen orientation

8 Embedding(포매) 포매시 조직의 방향 설정법 일반적으로 조직의 넓은 부위가 하향하도록 심는 것이 통례
여러 개의 작은 조각으로 의뢰된 검체는 번호가 있을 때는 번호 순서대로, 번호가 없을 때는 일렬로 나란히 심는다 내시경 생검조직, 자궁내막 소파조직 Embedding(포매)

9 Embedding(포매) 포매시 조직의 방향 설정법
난관 및 충수돌기 등 관상조직은 횡단면과 종단면이 모두 나오도록 하향하여 포매 피부(skin)조직의 경우 표피와 진피 부분이 다 나오도록 하나의 block에 포매 Embedding(포매)

10 Embedding(포매) 포매시 조직의 방향 설정법
침생검 조직인 경우 크고 작은 순서로 나란히 포매 - 간장, 신장, 갑상선, 골수 등 위, 장관계 조직의 경우 점막, 아점막, 근육, 장막층이 모두 나와야 되므로 세워서 포매 Embedding(포매)

11 Embedding(포매) 포매시 조직의 방향 설정법
림프절(lymph node)의 경우 - 겉 부분이 막으로 쌓여 있어 내부까지 침투가 잘 되지 않으므로 절반을 잘라서 포매 Embedding(포매)

12 Embedding(포매) 포매시 조직의 방향 설정법 근육, 신경조직의 경우 - 횡단면과 종단면으로 여러 조각으로 나누어 포매
골조직과 같이 단단한 조직은 약간 비스듬히 심어야 박절하기 쉽다. Embedding(포매)

13 Embedding(포매) 포매시 조직의 방향 설정법 수술경계부위(resection margin)의 경우
경계부위에 먹물을 칠해 표시하고, 전 경계 부위면이 고르게 나오도록 포매 방향 설정에 문제가 있을 때는 박절면의 뒤쪽에 홈을 파 주거나, 실로 묶거나, 먹물을 칠해 구분 Embedding(포매)

14 ORIENTATION OF TISSUE IN THE BLOCK
Embedding(포매)

15 Embedding center Base mold and plastic embedding ring
Tissue Embedding Cassettes

16 Embedding(포매) Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제)
Paraffin에 비해 조직의 위축이나 경화가 비교적 적게 발생 매우 큰 조직표본을 만들거나, 장기 전체를 표본제작 유기용매나 60℃의 열에 의해 조직이 손상 받는 일이 없어 신경, 뇌, 결체, 연골, 탈회된 골조직을 표본 제작할 때 안구(eye ball)와 같이 단단한 조직과 부드러운 조직이 분명한 경계를 이루고 있는 조직 침투과정을 실온에서 할 수 있고 Embedding(포매)

17 Embedding(포매) Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제) 침투에는 3~5주가 걸리고
표본제작이 완성되기 까지 2개월 이상이 소요 paraffin 절편 만큼 얇게 박절할 수 없고(약 10~15μm) 염색의 적용범위가 좁다 - 절편을 유리 슬라이드에 붙이지 않고 부유법으로 염색을 해야 하므로, 염색의 적용 범위가 넓지 못하다는 것 Embedding(포매)

18 Embedding(포매) Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제) Celloidin 용액의 제조
사용 전 물기를 건조한 다음 alcohol-ether 동량 혼합액에 용해하여 사용 탈수과정 50% alcohol(1~3일) → 70% alcohol(1~3일) → % alcohol(1~3일) → 95% alcohol(1~3일) → absolute alcohol(1~3일) → absolute alcohol (1~3일) → absolute alcohol : ether 동량혼합액 (1~3일) Embedding(포매)

19 Embedding(포매) Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제) 침투과정
2% celloidin → 4% celloidin → 8% celloidin →12% celloidin : 각각 2~7일 12 % celloidin에서 embedding 과정 후 microtome으로 조직을 cutting 가장 큰 문제인 공기중의 습기를 방지하기 위해 밀봉된 용기 내에서 absolute alcohol로 조직을 완벽하게 탈수해야 하며 ether도 필히 anhydrous ether를 사용 Embedding(포매)

20 Embedding(포매) Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제) 침투방법 - 습윤방법
골조직, 치아, 기관전체, 큰 뇌조직 등은 습윤방법을 이용 습윤방법에서는 block과 절편을 80% alcohol에 보관하고, 박절시에도 block과 칼을 80% alcohol에 적셔 두었다가 사용 침투방법 - 건조방법 안구의 침투에는 건조방법을 이용 건조방법은 cedarwood oil과 chloroform에 보관 Embedding(포매)

21 Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제)
Embedding(포매)

22 Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제)
Embedding(포매)

23 Celloidin 침투 및 포매법 (비수용성 포매제)
Embedding(포매)

24 Celloidin staining Embedding(포매)

25 Celloidin staining Embedding(포매)

26 Celloidin staining Embedding(포매)

27 뇌조직의 celloidin embedding block 이다. 다음 설명 중 틀린 것은?
포매블록은 80 % 알코올에 보관 2um의 얇은 절편 생산 가능 셀로이딘의 용매제로는 무수알코올과 에테르 동량 혼합액 사용 뇌조직의 박절에 효과적

28 Embedding(포매) Carbo wax 침투 및 포매법 (수용성 포매제)
중합의 정도에 따라 분자량이 작은(1,000 이하) 경우는 액체상, 그리고 분자량이 1,500 이상 (젤리와 같은 강도)은 바세린상, 4,000이상 (경질paraffin 정도의 강도)은 경질파라핀 정도의 경도로 커질수록 고체상 침투에는 분자량이 4,000인 것과 1500이 사용 수용성 침투제이므로 고정이 끝난 조직을 탈수나 투명 과정을 거치지 않고 고정된 조직을 직접 침투시킬 수 있어서 조직의 위축 및 경화, 뒤틀림이 적고, 과정이 간단하며, 효소조직 화학검사로서 효소의 증명에 이용 Embedding(포매)

29 Embedding(포매) Carbo wax 침투 및 포매법 (수용성 포매제)
침투제가 물에 쉽게 용해되기 때문에 포매 블록이 약하고 박절과 박절된 절편을 부유항온수조 (flotation bath)에서 처리하는 작업이 불편 지방조직에는 침투제가 수용성인 관계로 침투가 어렵고, 인지질이 많은 뇌나 척수에 매우 느리게 침투되는 것이 단점 Carbo wax는 흡습성이어서 쉽게 연화되기 때문에 포매 블록(embedding block)의 보존도 어렵다. Embedding(포매)

30 Embedding(포매) Carbo wax 침투 및 포매법 (수용성 포매제) Carbo wax 침투
분자량이 4,000과 1,500을 9 : 1의 비율로 혼합하여 175℃에서 30초간 가열한 후, 56℃ incubator에 보관하면 액체상태가 된다. 침투는 56℃ incubator에서 1~3시간 정도 한다. 침투가 완료되면 조직이 용기의 아래로 가라 앉는다. Carbo wax 포매 침투가 완료된 조직은 포매상자에 새로 준비한 침투제를 붓고 그 안에 조직을 배열한다. Embedding(포매)

31 Embedding(포매) Carbo wax 침투 및 포매법 (수용성 포매제) Carbo wax block 굳히기
block을 굳힐 때는 습기를 방지하기 위해 뚜껑을 덮고 냉장고에서 block 을 단단하게 굳힌다. 굳으면 칼이나 spatula를 뜨겁게 달구어 삭정하고, 대목에 corbo wax block을 부착 박절하기 전까지 block을 습기를 피할 수 있는 곳에 보관하며, 박절은 rotary microtome으로 약 10 μm의 두께 Embedding(포매)