Glucose Sensor 화공생명공학과 20031263 최진하.

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1 Glucose Sensor 화공생명공학과 최진하

2 Contents Purpose 1 Theory 2 Procedure 3 Data & Result 4 Discussion 5

3 실험 목적 Cyclic Voltammetry와 Chronoamperometry의 기본개념 이해와 전기화학 실험 수행 당센서를 GOD를 이용하여 제작, Glucose 양 측정

4 실험 이론 전기 화학 계측법 전위규제법 전류규제법 전기량규제법

5 Chronoamperometry 작용전극의 전위를 규제하여 전류와 시간관계를 측정하는 방법 작용전극의 전위를 E1으로 설정
환원을 일으키는 E2 또는 E3까지 스텝 전극 표면에서 환원이 일어남 농도 구배의 감소로 전류는 감소

6 Chronoamperometry 확산 지배 전류는 Cottrell식으로 표현 한계전류
전극 근처에서 반응물의 농도가 0에 근접할 때 흐르는 전류의 세기

7 Cyclicvoltammetry 작용전극의 전위를 시간에 따라 변화시키면 전류-시간 곡선은 전위-시간 곡선에 대응
반복적인 전위 주사 전류-전위 곡선을 측정하는 방법 - 정성분석 : 물질에 따라 반응하는 전위가 다름 - 정량분석 : 전류는 농도에 비례

8 Cyclicvoltammetry 반응량 증가로 인한 반응물량 감소 반응속도< 확산속도 반응속도 > 확산속도

9 Cyclicvoltammetry 피크전위 전자의 개수

10 Glucose Oxidase(GOD) 산소를 electron accepter로 사용 β-D-glucose 를 산화시켜서 D-glucono-1,5-lactone과 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매

11 Enzyme Kinetics 단일 기질-효소 촉매 반응의 속도식 -- Michaelis-Menten 속도론 두 가지의 가정
빠른 평형 가정 유사 정상상태 가정

12 Enzyme Kinetics 세 가지의 식이 필요함 (1) (2) (3)

13 Enzyme Kinetics 세 식을 정리하면 윗 식을 이중역수를 취하면

14 생체 유기물 + 반도체(무기물) ▶생체정보 감자소자
Biochip 생체 유기물 + 반도체(무기물) ▶생체정보 감자소자 단백질 칩 DNA 칩 Lap-on-a chip 활용가치가 높음 필요한 단백질 확보 어려움 변성되고 깨지기 쉬움 특정 유전자의 존재 유무 확인 병의 원인, 이상 유전자등을 찾음 미량의 분석대상 물질 분석 흘려 보내면서 칩 안의 생물분자, 센서와 반응

15 Biochip

16 Bio Sensor 주로 생체성분을 대상으로 하는 화학물질 계측 디바이스 (화학정보 전기신호)

17 실험 방법 (1) Cyclic voltammetry Working electrode polishing 방법
ⓐ 0.3μm의 alumina powder를 2차 증류수에 disperse하여 polishing pad에 뿌리고 polishing pad에 glassy carbon working electrode를 평행하게 3~4분 정도 돌리면서 갈아준다. ⓑ Working electrode를 EtOH와 2차 증류수로 씻어준다. ⓒ Working electrode를 EtOH 50%와 2차 증류수 50%를 넣은 tube에 넣어주고 sonication 시켜준다.(2~3분) ⓓ N2 gas로 말려준다.     .

18 실험 방법 Fe3(CN)63- / Fe2(CN)4-6 couple의 Cyclic Voltammetry
ⓐ 1.0mM K3Fe(CN)6 , 0.1 M KNO3 solution 5mL를 Electrochemical cell에 넣고 electrode를 배치시킨다. ⓑ Cyclic voltammetry program을 컴퓨터상에서 실행시킨다. ⓒ Cyclic voltammetry의 Potential 범위, scan rate, currunte range를 선택한다.   (Scan rate는 각각 10mV/s, 20mV/s, 50mV/s, 100mV/s, 200mV/s에서 실행한다.) ⓓ Program 시작과 동시에 cyclic voltammetry 기기를 sweep한다.   (이 실험은 황눵부터 실행되므로 negative scan을 실행하여 준다.) ⓔ Cyclic voltammogram을 얻는다.

19 실험 방법 (2) Chronoamperometry
ⓐ 1.0 mM  K3Fe(CN)6 , 0.1 M KNO3 solution 2 mL를 Electrochemical cell에 넣고 electrode를 배치시킨다. ⓑ 위의 용액을 이용하여 일정한 전압(환원전위)을 걸어준 후 바탕 용액만 있을 때 용액을 저어주지 않을 때와 용액을 저어 주었을 때의 i-t 그래프를 비교해본다.

20 실험 방법 (3) 당 센서 제작 및 측정 표면에 고정된 GOD를 이용하여 glucose를 측정한다

21 실험 방법 (3) 당 센서 제작 및 측정 ⓐ 백금 작업 전극(Pt working electrode)을 polishing 한다.
ⓑ Polishing 한 백금 전극표면에 GOD 1μL를 loading한다. ⓒ GOD가 완전히 마른 후 GOD를 전극 표면에 고정시키기 위해 Nafion 1μL를 loading한다. ⓓ 이렇게 준비된 작업 전극을 상대 전극 (Pt counter electrode), 기준 전극(Ag/AgCl reference electrode)과 함께 potentiostat에 연결하고 0.1M, pH7.0 phosphate buffer 5mL에 담근다. 이때 용액은 magnetic stirrer를 이용하여 계속 저어준다. ⓔ GOD에 의해 glucose가 산화되면서 생성되는 H2O2 를 측정하기 위해 0.6V(va.Ag/AgCl)의 산화전압을 걸어준다. ⓕ Background가 안정되면 0.25M의 glucose를 micro-syringe를 이용해서 20μL씩 injection한다. (1mM씩 증가한다.)

22 실험 결과 Cyclicvoltammetry 1) Scan rate 변화에 따른 cyclicvoltammetry 1전자 반응
0.16

23 실험 결과 2)(Scan rate)1/2에 대한 peak current

24 실험 결과 2)(Scan rate)1/2에 대한 peak current

25 실험 결과 (2) 용액 교반 유무에 따른 chronoamperometry

26 실험 결과 (3) 당 센서 제작 및 당 측정 Glucose injection에 따른 시간에 대한 current의 변화

27 실험 결과 2) Calibration curve

28 실험 결과 3) Lineweaver-Burk plot

29 토의 Cyclicvoltammetry에서 scan rate와 peak current의 관계를 알 수 있었고 1전자 반응을 확인할 수 있었다. Chronoamperometry에서 교반유무에 따른 한계전류 값의 차이를 볼 수 있었다. 당센서 실험에서 glucose의 양에 따른 선형적인 전류의 변화를 확인할 수 있었다.

30 토의 노이즈가 생긴 이유? 교반이 일정하게 되지 않았음 Injection시 전극을 건드림 시료의 양이 적음
실험을 여러 번 반복해서 buffer용액의 오염

31 토의 실험시 어려웠던 점 Polishing : 전극 표면을 깨끗하게 처리

32 Application 가장 많이 응용되는 분야는 의약분야 환경분야, 가정분야에도 영향을 미침 Ex) 일본에서는 당센서 부착한 좌변기 도입

33 참고 문헌 (1) 이동진, 최호상, 전기화학 개론, 도서출판 아진, 2001, pp 206-208, pp 213-242
(2) Osaka, T.   전기화학측정법,   자유아카데미,  1994,   pp , pp (3) 정윤수,   바이오센서,   고려의학,   1994,   pp 5-12, pp (4) (5) (6)

34 감사합니다!